甲基叶酸盐通用名为6S-5-甲基四氢叶酸钙((6S)-5-MTHF-Ca)，被称为天然化叶酸（Naturalization folate），是活性化叶酸的迭代升级。天然化叶酸在体内不受叶酸代谢酶影响，可直接转化为6S-5-MTHF被人体吸收利用，补充天然化叶酸可避免因过量摄入合成叶酸而产生的危害。目前在甲基叶酸盐的应用上还处于起步阶段，市面上常见产品形式仍停留在膳食补充剂上。乳中含有丰富的营养成分和生物活性成分，对乳体系进行天然化叶酸强化可达到增补叶酸的目的，同时满足特殊人群对多种营养的需求。研究表明，液态乳是一种潜在叶酸强化基质。2020年国家卫生和计划生育委员会扩大了甲基叶酸盐的使用范围，批准添加至调制乳、调制乳粉（仅限儿童用乳粉和孕产妇用乳粉）中，使用量与GB 14880—2012《食品安全国家标准食品营养强化剂使用标准》中规定的叶酸使用量一致。
天然乳中含有的蛋白质、脂肪等会对叶酸测定造成干扰。与微生物法测定乳品中叶酸含量相比，高效液相色谱法（High-pressure liquid chromatography，HPLC）操作简单，稳定性强，准确性高，因此使用HPLC法测定乳体系中甲基叶酸盐。
分析方法[1]
1、样品前处理方法制备
甲基叶酸盐强化乳（1.2μg/mL），精确称取0.1g纯度为99.5%的甲基叶酸盐加适量液态乳超声辅助溶解后置于100mL棕色容量瓶中，并用液态乳定容至刻度，准确移取10mL甲基叶酸盐液态乳溶液于50mL棕色容量瓶中，用液态乳定容至刻度，浓度为200μg/mL。准确移取浓度为200μg/mL的甲基叶酸盐液态乳溶液0.30mL于50mL容量瓶中，用液态乳定容至刻度。
方法 1：称取0.25g L-抗坏血酸于离心管中，取45mL甲基叶酸盐强化乳充分溶解，于（83.7±0.2）℃水浴锅中处理30min，冷却至室温，加入2.5%复合蛋白酶，混匀，于（45±0.2）℃水浴锅中处理2h，加入5mL萃取剂（3.2%乙酸溶液），混匀，6000r/min离心10min，取上清液经0.22μm过滤 器过滤。
方法 2：吸取5mL甲基叶酸盐强化乳于离心管中，分别按样品溶液体积1∶4加入0.057mol/L抗坏血酸溶液和0.285mol/L β-巯基乙醇溶液，于83.7℃水浴锅中处理30min后，冷却至室温，加入2.5%复合蛋白酶，混匀，于（45±0.2）℃水浴锅中处理2h，按样品溶液体积1∶1加入3.2%乙酸溶液，混匀，6000r/min离心10min，取上清液过滤。
方法 3：吸取5mL甲基叶酸盐强化乳于离心管中，分别按样品溶液体积1∶4加入0.057mol/L抗坏血酸溶液和0.285mol/L β-巯基乙醇溶液，于83.7℃水浴锅中处理30min后，冷却至室温，按样品溶液体积1∶1加入3.2%乙酸溶液，混匀，6000r/min离心10min，取上清液过滤。
2、色谱条件
色谱柱：ShimNex HE C18-AQ柱（250mm×4.6mm，5μm）。流动相 A：用10.8mol/L NaOH溶液调节NaH2PO4·2H2O缓冲溶液pH至6.5。流动相 B：按照甲醇∶NaH2PO4·2H2O缓冲溶液=7∶13（V/V）比例混匀，用10.8mol/L NaOH溶液调节pH至8.0。流速 1.1mL/min，检测波长280nm，进样量10μL，柱温32℃；运行时间33min。梯度程序见表1，检测甲基叶酸盐检出值，计算回收率。
参考文献
[1] 魏家乐,王冰洋,许天月,等. 液态乳中6S-5-甲基四氢叶酸钙检测方法的建立及应用[J]. 中国乳品工业,2026,54(4):66-71,80. DOI:10.19827/j.issn1001-2230.2026.04.009.