介绍
考迈斯托醇(Coumestrol)，又名拟雌内酯、香豆雌酚，化学名称5，14-dihydroxy-8，17-dioxatetracyclo[8.7.0.02,7.011,16 ]heptadeca-1(10),2(7),3,5,11,13,15-heptaen-9-one，化学式C15H8O5。其主要存在于豆科植物紫苜蓿(Medicago sativa L)全草，菊科植物药用蒲公英(Taraxacum officinale Wigg)等植物中，为黄酮、香豆素及类似物，具有雌激素样作用，可抗真菌。
图一 考迈斯托醇
在细胞外的无义突变通读活性
(1)快速用手融化 T7 Quick for PCR DNA Master后置于冰上，同时室温融化其他试剂置于冰上。
(2)在0.5ml离心管中混合反应组分：蛋氨酸1μl， T7 Quick for PCR DNAMaster混合物40μl，无义突变ATM基因或野生型ATM基因质粒500ng，考迈斯托醇或G418阳性对照(终浓度均为10μM)、DMSO阴性对照各0.5μl，用无核酸酶的去离子水定容到50μl。用移液器上下抽吸或吸头搅动等方法温和混合，如有必要，短暂离心。
(3)30℃孵育90min。如果几个小时内就用，可将上述反应混合物贮存在于4℃。否则储存在-20℃。
(4)将384孔白色MaxiSorp ELISA平板用20μl的5μg/ml小鼠抗Myc抗体(Invitrogen公司)包被，4℃过夜。
(5)PBS缓冲液洗酶标板3次，每次80μl。然后用80μl的PBSTM(含0.05％Tween20和5％奶粉的PBS)封闭酶标板，37℃ 30min。
(6)加200μl的H 2 O到上述50μl的PTT反应后的体系，总体积为250μl，充分混匀。
(7)取100-120μl的PTT反应溶液到酶标板(每孔100μl，每个样本可以做2-3次)，用塑料封条密封酶标板，室温孵育过夜。
(8)用80μl的PBST(此处为PBSTM不加奶粉)洗3次，弃去洗液。
(9)每孔加20μl的1∶500的HRP标记小鼠抗V5抗体，37℃孵育2h，或室温过夜。
(10)用80μl的PBS洗涤3次，弃去洗液。
(11)配制SuperSignal ELISA Pico溶液(Thermo Fisher Scientific公司)，每孔加30μl，1min后检测化学发光强度。
(12)化学发光检测结果：考迈斯托醇处理后，相对发光值显著升高到918±228.587(P＜0.05)，是野生型的34.5％；而阳性对照G418处理后，相对发光值升高到898±171.716(P＜0.05)，是野生型的33.7％；从V5蛋白表达的结果可看出，考迈斯托醇具有无义突变通读活性，且略强于G418。
对正常细胞活性的毒性分析
以商用人肺上皮细胞16HBE细胞为模型，以G418作为对照，用梯度浓度的考迈斯托醇进行处理(0、6.25、12.5、25、50、100μmol/L)，培养48h后，按CCK8细胞活性检测试剂盒说明操作，检测各处理中细胞的存活率：
(1)接种细胞悬液于96孔板中，100μL/孔，每孔细胞数量＞1000。将培养板在培养箱预培养，于37℃，5％CO2的条件下稳定过夜。
(2)做细胞数目测定实验时，向每孔加入10μL CCK8溶液，注意不要生成气泡。
(3)将培养板在37℃，5％CO2的培养箱内孵育2小时。
(4)用酶标仪测定在450nm处的吸光度(OD值)。
每个实验样本均独立操作，实验重复三次以上，数据经统计学分析。实验结果表明，0～50μmol/L的药物浓度处理中细胞存活率均大于80％，整体上考迈斯托醇对正常细胞的毒性略小于G418(图二)，提示在选择和应用药物时需注意把控浓度。考迈斯托醇具有较好的无义突变通读活性，具有成为先导化合物的能力，通过进一步的结构改造和优化能够制成无义突变通读药物，可用于治疗无义突变所致的肿瘤，同时可成为无义突变所致遗传病的潜在治疗药物[1]。
图二 对正常细胞活性的毒性分析
参考文献
[1]武汉科技大学. 考迈斯托醇的无义突变通读活性用途:CN201711141407.6[P]. 2019-05-14.