前言
对硝基苯胺显色底物是研究蛋白酶动力学和筛选酶抑制剂的一类重要生化试剂，其经过特定酶水解产生的游离对硝基苯胺在405nm波长具有明显吸收峰，且具有整个过程中所需的显色试剂用量少、灵敏度高、稳定性好等优点，因此在科学研究及体外诊断领域得到广泛应用。鲎试剂三肽全称：N‑叔丁氧羰基‑L‑亮氨酰‑甘氨酰‑L‑精氨酸对硝基苯胺，就是常用的内毒素显色底物，白色至浅米黄色冻干粉末，易溶于DMSO、DMF；可溶于弱碱性Tris缓冲液；水溶液不稳定，现配现用。
制备方法
1、称取L‑精氨酰‑对硝基苯胺(14.71g,50mmol)、EDCI(14.3g,75mmol)、NHS(8.63g,75mmol)、BOC‑L‑甘氨酸(10.51g,60mmol)加入1000mL圆底烧瓶中，加入DIPEA(13mL,75mmol)及400mL DCM，室温下搅拌反应18h，反应完成后用纯化水萃取3×500mL、有机相经无水硫酸钠干燥、减压浓缩除去溶剂得到浅黄色粘稠状BOC‑L‑甘氨酰‑L‑精氨酸‑对硝基苯胺21.32g，备用。
2、称取BOC‑L‑甘氨酰‑L‑精氨酸‑对硝基苯(18.05g,40mmol)置于250mL圆底烧瓶中，加入150mL含1 .5mol/L的HCl的50％乙醇溶液，室温下反应2h，减压抽滤并用100mL50％乙醇溶液洗涤滤饼，真空干燥得类白色固体状L‑甘氨酰‑L‑精氨酸‑对硝基苯10.81g，备用。
3、称取L‑甘氨酰‑L‑精氨酸‑对硝基苯(8.78g,25mmol)、EDCI(7.15g,37.5mmol)、NHS(4.32g,37.5mmol)、BOC‑L‑亮氨酸(6.94g,30mmol)加入1000mL圆底烧瓶中，加入DIPEA(6.5mL,37.5mmol)及200mL DCM，室温下搅拌反应18h，反应完成后用纯化水萃取3×300mL、有机相经无水硫酸钠干燥、柱层析纯化后得到白色固体状鲎试剂三肽10.37g，HPLC纯度98.5％，收率：72.39％。所得鲎试剂三肽的质谱及核磁氢谱数据如下：MS‑ESI(m/z):565.21[M+H]+；1HNMR(400MHz,DMSO‑d6)δ:10.11(s,1H,‑CONH),8.51(s,1H,‑CONH),8.17(d,2H,ArH),8.10(br,1H,‑CONH),8.02(br,1H,‑CONH),7.89(d,2H,ArH),7.25(br,3H,‑NH,‑NH2),4.45(m,1H,‑CH),3.95(m,1H,‑CH),3.62～3.85(m,2H,‑CH2),3.15(s,2H,‑CH2),2.62(s,1H,‑NH),1.85～1.39(m,7H,‑CH2,‑CH),1.41(s,9H,‑CH3),0.94(d,6H,‑CH3)[1]。
参考文献
[1] 郑州安图生物工程股份有限公司. 一类对硝基苯胺类化合物的制备方法:CN202310007556.2[P]. 2023-04-18.