介绍
阿奇霉素德糖胺（Desosaminylazithromycin），又称去克拉定糖阿奇霉素，是第二代大环内酯类抗生素阿奇霉素在水溶液环境中发生降解反应时生成的最主要降解产物，也是阿奇霉素液体制剂稳定性评价与质量控制体系中最核心的降解杂质标志物，其形成本质是阿奇霉素分子结构中C3位糖苷键发生水解断裂的结果。具有15元氮杂内酯母核骨架，以及通过β-糖苷键连接在母核C5位的氨基糖D-去氧糖胺结构；而原本以糖苷键形式连接在母核C3位的中性糖L-克拉定糖，则在水解反应中脱离母核，使母核C3位转化为游离的羟基基团。分子内同时存在两个具有碱性的可质子化氮原子，其一位于15元内酯环的9a位氮杂位点，其二为去氧糖胺结构上的二甲氨基侧链。
图一 阿奇霉素德糖胺
电喷雾质谱下的离子化行为与裂解规律
在电喷雾正离子模式的质谱分析中，阿奇霉素德糖胺呈现出独特的离子化特征：它既可以形成常规的准分子离子[M+H]+，对应质荷比为591，也可以在酸性环境下使两个氮原子同时发生质子化，形成丰度更高的双电荷离子[M+2H]2+，对应质荷比为296；尤其在含有三氟乙酸的酸性流动相体系中，双电荷离子的检测灵敏度显著高于单电荷准分子离子，这一特性可被用于该降解产物的高灵敏定性与定量分析。在碰撞诱导解离的二级质谱实验中，当以双电荷离子m/z 296作为母离子进行分析时，低碰撞能量下首先发生C5位β-糖苷键的断裂，完整脱去去氧糖胺结构，生成对应内酯母核的碎片离子m/z 434，同时产生去氧糖胺的特征阳离子碎片m/z 158；随着碰撞能量逐步升高，母核碎片会进一步发生连续的脱水反应，依次失去一分子与两分子水，生成m/z 416与m/z 398的特征碎片，最终母核骨架发生断裂产生一系列更小质量数的碎片离子；若以单电荷准分子离子m/z 591作为母离子进行二级质谱分析，除上述全部碎片信号外，还会出现完整分子失去一分子水形成的特征碎片离子m/z 573，这一离子是单电荷母离子特有的裂解产物。
图二 AZM的主要降解途径
水溶液中的生成动力学及关键影响因素
阿奇霉素德糖胺的生成速率与阿奇霉素的整体降解行为高度关联，母体阿奇霉素在水溶液中的降解遵循准一级反应动力学规律，其浓度增长过程则符合零级反应动力学特征。在pH 4.0至7.2的考察范围内，阿奇霉素在0.05 mol/L磷酸钾缓冲体系中于pH约6.3处达到最大稳定性，生成速率最慢；当溶液pH低于6.3时，酸性的增强会显著加速C3位糖苷键的水解进程，使降解产物的生成速率快速上升，此时降解速率常数的对数值与pH呈斜率为-0.57的线性关系，提示该区间内的降解反应遵循广义酸催化机制；当溶液pH处于6.3至7.2的区间时，降解速率会随着pH的升高再次上升，对应广义碱催化的降解路径。
图三 ESI-MS正离子全扫描光谱测得阿奇霉素德糖胺
缓冲体系的种类与浓度同样对产物生成速率有显著影响，在相同pH、离子强度与温度条件下，柠檬酸钠缓冲体系中阿奇霉素的降解速率最快，阿奇霉素德糖胺生成速率最高，乙酸钠缓冲体系次之，磷酸缓冲体系最为稳定，且磷酸缓冲液中的阳离子种类（钾离子或钠离子）对降解速率无明显影响；与此同时，随着磷酸缓冲液的浓度从0.02 mol/L升高至0.10 mol/L，降解速率持续上升，这一现象进一步验证了pH 6.0条件下广义酸催化机制的存在。溶液的离子强度也会对降解过程产生调控作用，通过加入氯化钾调节离子强度的实验显示，随着离子强度从0.3 mol/L升高至1.0 mol/L，降解速率常数的对数值与离子强度的平方根呈良好的线性关系，线性斜率为1.05，与德拜-休克尔方程的理论预测值高度吻合，说明该降解反应发生在带同种电荷的粒子之间，结合阿奇霉素的pKa特征可推断，酸性条件下质子化的阿奇霉素分子与氢离子的相互作用是驱动糖苷键水解的核心因素。
温度对降解过程的影响则完全符合阿伦尼乌斯方程，在70℃至100℃的考察温度范围内，降解速率常数的自然对数值与热力学温度的倒数呈良好线性关系，由此计算得到阿奇霉素降解的表观活化能为96.8 kJ/mol，基于该活化能参数可外推得到25℃与40℃等常温条件下的降解速率。此外，向体系中加入不同浓度的乙二胺四乙酸二钠并未显著改变降解速率，说明痕量金属离子不参与该降解反应，无需通过添加金属离子螯合剂来抑制阿奇霉素德糖胺的生成；而阿奇霉素的初始浓度在2~10 mg/mL的范围内对降解速率无明显影响[1]。
参考文献
[1]Yu Z ,Xiaoliang L ,Yue C , et al.Aspects of Degradation Kinetics of Azithromycin in Aqueous Solution[J].Chromatographia,2009,70(1-2):67-73.DOI:10.1365/s10337-009-1116-x.