显色是ELISA实验中将酶催化反应转化为可检测信号（通常是颜色变化）的关键步骤。显色时间过短会导致信号弱、灵敏度下降；时间过长则可能引起背景升高、非特异性显色或信号饱和，最终影响结果的准确性和重复性。因此，精确控制显色时间至关重要。以下是一些关于显色时间的掌握技巧：
一、显色时间控制标准
1、正向曲线（夹心法/间接法）：
最高浓度标准品OD450值控制在2.0-2.8（最佳2.2-2.5）。
显色终点判断：S4-5孔呈淡蓝色，S5孔深蓝色。
2、反向曲线（竞争法）：
空白孔OD450值控制在2.2-3.0（最佳2.5-3.2）。
显色终点：阴性孔保持无色，阳性孔显色加强。
二、操作优化技巧
1、温度与时间：
37℃避光显色15-30分钟，TMB底物约40分钟达峰值。
定性实验可室温操作，根据对照孔显色调整时间。
2、仪器监测：
630 nm波长下，S1孔OD值0.5-0.7、S5孔0.05-0.08时终止反应。
高灵敏度试剂盒需缩短显色时间30%。
三、常见问题处理
显色不均：检查加样速度、移液器校准，避免气泡产生。
背景过高：增加洗涤次数（5次）或提高Tween-20浓度（0.05%-0.1%）。
信号弱：延长显色时间或更换高灵敏度底物。
四、建议：
最佳实践是：在实验前仔细阅读试剂盒说明书，确定推荐的显色条件（温度、时间）。开始显色后，从推荐时间的一半左右开始密切观察阳性对照孔的颜色发展，当达到预期的显色强度（通常比阴性孔深得多）时，立即加入终止液。对于严格的定量分析，务必使用计时器，确保所有板子的显色时间完全一致，以保证数据的可比性。