外周血单个核细胞（PBMC）是免疫学中最常用的生物标本之一[1] , 主要由几类免疫细胞组成，包括 T 细胞 (~70%)、B 细胞 (~15%)、单核细胞 (~5%)、树突状细胞 (~1%) 和自然杀伤 (NK) 细胞 (~ 10%)。[2][3]
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图1：细胞类型划分
PBMC也是ELISPOT/FluoroSpot检测中使用最多的样本类型，主要采用密度梯度离心（Ficoll）法进行分离，制备好的PBMC样本可立即使用，也可进行冷冻保存。本期和大家分享PBMC样本分离、冻存及复苏的操作流程，期待能对大家优化实验样本质量有所帮助！
图2：PBMC样本特点
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一、分离
对于全血的采集，市面上有多种含有不同抗凝血剂的血液采集管，其中肝素管和柠檬酸盐管最适合ELISPOT（EDTA通过钙螯合抑制凝血，钙螯合在抗原特异性再刺激期间会损害细胞因子诱导），采集后的样本应在室温（20-26℃）条件下，储存不超过8小时。
图:3：肝素钠采血管（左）&柠檬酸盐采血管（右）
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材料准备
1. 血液样本（全血或血白膜层）；
2. Ficoll-Paque试剂（无菌）；
3. 常温离心机；
4. 移液管（无菌，塑料材质玻璃材质）；
5. 自动移液器和无菌吸头；
6. PBS，无菌或无血清的培养基（例如RPMI1640）；
7. 聚丙烯离心管：15/50ml，无菌；
确保所有试剂温度与室温一致，在无菌条件下工作
图4：白膜层制备及分布
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操作步骤
1.全血：用PBS 2倍稀释；
2.白膜层：与全血相比，白膜层中的细胞密度更大，因此应该稀释更多（约3倍）；
3.准备装有Ficoll-Paque试剂的离心管（考虑总体积选用15/50ml试管，15ml试管加入5mlFicoll试剂，50ml试管加入15mlficoll试剂）；
4.沿着试管壁（15ml），在ficoll上层轻轻加入8ml稀释的血液，50ml试管加入25ml稀释血液；
5.离心（400g，30min，RT）；
6.离心后，直接用移液管小心收集PBMC（或者先移去上层血浆再进行收集）到新的离心管，用PBS或；不含血清的培养基填充新试管；
7.离心（400g，10min），去上清，加入PBS或不含血清的培养基重悬（重复两次）；
8.标记体积，取小部分进行细胞计数；
9.离心（400g，10min）；
10.即刻使用：去上清，重悬；亦可冻存；
图5：PBMC制备流程图
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梯度密度离心法制备PBMC效果为什么总是不好？
二、冻存
材料准备
1.冷冻培养基：RPMI1640（含2mM 左旋谷酰胺）+20% FCS和10% DMSO。如果细胞适合无血清培养基，则使用7% DMSO；
2.冷冻容器，聚丙烯离心管（15/50ml，无菌）；
3.自动移液器，无菌吸头；
4.冷冻管（例如1.8ml）；
5.-80℃冰箱、-150℃冰箱/液氮罐；
在开始冷冻操作前，贴好相应冷冻管标签，防止冷冻培养基在室温下放置过长时间，否则会影响细胞活力
操作步骤
1.将经过离心的PBMC去上清，加入冷冻培养基，将细胞浓度稀释至5-25X106个/ml（无血冷冻培养基稀释至1X106个/ml），转移至冷冻管（eg.1ml），并转移到冷冻容器中，确保细胞悬浮。
2.迅速将冷冻容器放入-80℃的冷冻设备中，保存时间建议在4小时~1周之间。
3.将冷冻管从冷冻容器中转移到-150℃的冷冻设备中进行长期储存。
对于1.8ml冷冻管，可加入1ml细胞悬液进行冷冻保存，若使用其他尺寸的冷冻管，要确保加入的细胞悬液小于最大体积，防止液体在冷冻过程中膨胀溢出。
三、复苏
材料准备
1.细胞培养基：RPMI 1640（含2mML-谷氨酰胺）+10%FCS，10mM HEPES和100µg/mL青霉素+ 100µg/mL链霉素
2.37℃水浴设备
3.聚丙烯离心管：50 ml和/或15 ml，无菌
4.移液器+吸头
5.自动助吸器+移液管
6.常温离心机
7.37℃CO2培养箱
开始前，水浴锅预热到37℃，预热培养基，后续洗涤步骤可在室温下进行。
操作步骤
1. 将冻存管从冷冻储藏室中迅速转移到37℃的水浴中，解冻直至管中仅存细小冰晶；
2. 缓慢向冷冻管中加入0.5-1ml细胞培养基，重悬后将悬液转移到15ml试管中，用1ml细胞培养基填充；
3. 冻存管并转移到15ml试管，用细胞培养基填充；
4. 离心（300g 10min），去上清，轻拍管体使细胞排列松散。加入1ml的细胞培养基，以移液器吹打、重悬，加培养基至体积为15ml；
5. 离心（300g 10min），去上清，加入1ml的细胞培养基，根据预期细胞浓度添加培养基；
6. 将细胞放入CO2 培养箱中，培养1h，盖子稍留缝隙（可利用此间隙来进行ELISPOT/Fluorospot板的预处理与封板）；
如果一次需处理多个冷冻管，要尽快进行，冷冻培养基中的DMSO可能会影响细胞活性。
7. 孵育结束后，重悬，静置1min使聚集的细胞碎片沉淀。将没有沉淀的细胞悬液小心地转移到新的15ml试管中；
8. 细胞计数，确定细胞活性：计数可以采用自动细胞计数仪或显微镜下台盼蓝染色进行，要尽可能排除死细胞和即将凋亡的细胞，因为实验中仅有活细胞才能在刺激后分泌细胞因子。如果细胞活性和浓度低于要求，则需再次离心，重悬并稀释至正确的体积。
参考
[1]. Díaz I. Rules of thumb to obtain, isolate, and preserve porcine peripheral blood mononuclear cells. Vet Immunol Immunopathol. 2022 Sep;251:110461. doi: 10.1016/j.vetimm.2022.110461. Epub 2022 Jul 16. PMID: 35870231.
[2]. Autissier, P., Soulas, C., Burdo, T. H., and Williams, K. C. (2010). Evaluation of a 12-color flflow cytometry panel to study lymphocyte, monocyte, and dendritic cell subsets in humans. Cytometry A. 77, 410–419. doi: 10.1002/cyto.a. 20859
[3]. Kleiveland, C. R. (2015). “Peripheral blood mononuclear cells,” in The Impact of Food Bioactives on Health, eds K. Verhoeckx, P. Cotter, I. López-Expósito, C. Kleiveland, T. Lea, A. Mackie, T. Requena, D. Swiatecka, H. Wichers (Springer), 161–167.