胃蛋白酶(Pepsin)试剂盒说明书
分光光度法 50管/24样
注 意: 正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
胃蛋白酶(Pepsin)试剂盒测定意义:
胃蛋白酶由胃粘膜主细胞分泌,分解食物中蛋白质成小肽段。一般用于神经性低酸症的鉴别,慢性胃炎、慢性胃扩张、慢性十二指肠炎等症状时也会引起胃蛋白酶分泌的减少。
测定原理:
胃蛋白酶可催化血红蛋白水解,水解产物与福林试剂反应后显蓝色;一定范围内,其颜色的深浅与胃蛋白酶活性呈正比。
自备仪器和用品:
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制:
试剂一:液体50mL×1瓶,4℃保存。
试剂二:液体50mL×1瓶,4℃保存。
试剂三:粉剂×1瓶,4℃避光保存。临用前加入25 mL试剂二充分溶解。
试剂四:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加入25 mL蒸馏水充分溶解。
试剂五:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加入30 mL蒸馏水充分溶解。
试剂六:液体5mL×1瓶,4℃保存。
标准品:液体1.26mL×1支,0.5 μ mol/mL酪氨酸标准溶液浓度4℃保存。
胃蛋白酶(Pepsin)试剂盒粗酶液提取:
组织样品:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)冰浴匀浆,8000g,4℃离心10min,取上清,即粗酶液。
测定步骤:
1.分光光度计预热30min,调节波长到580 nm,蒸馏水调零。
2. 试剂三和试剂四置于37℃水浴预热30min。
3. 标准管:取玻璃比色皿,加入100μL标准品,200μL试剂二,600μL试剂五,100μL试剂六,混匀后室温静置20min,于580 nm测光吸收,记为A标准管。
4. 空白管:取玻璃比色皿,加入100μL蒸馏水,200μL试剂二,600μL试剂五,100μL试剂六,混匀后室温静置20min,于580 nm测光吸收,记为A空白管。
5. 对照管:取EP管,加入500 μL蒸馏水,置于37℃水浴保温10min;加入500μL试剂四,盖紧后摇匀1min;加入100μL粗酶液,混匀后8000g 4℃离心10分钟取上清;在玻璃比色皿中加入上清液100μL,再加入200μL试剂二,600μL试剂五,100μL试剂六,混匀后室温静置20min,于580 nm测光吸收,记为A对照管。
6. 测定管:取EP管,加入100μL粗酶液,500 μL试剂三,置于37℃水浴保温10min;加入500μL试剂四,
盖紧后摇匀1min;8000g 4℃离心10分钟取上清;在玻璃比色皿中加入上清液100μL,再加入200μL试剂二,600μL试剂五,100μL试剂六,混匀后室温静置20min,于580 nm测光吸收,记为A测定管。
注意:空白管和标准管只需要测定一次。
胃蛋白酶(Pepsin)试剂盒计算公式:
(1) 按照蛋白浓度计算
活性单位定义:37℃每毫克蛋白每分钟催化血红蛋白水解生成1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
胃蛋白酶活性(nmol/min/mg prot)=C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×稀释倍数÷(Cpr×V1)÷T=5500×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷Cpr
C标准品:标准品浓度,0.5 μ mol/mL酪氨酸;稀释倍数:(100+500+500)÷100=11;Cpr:粗酶液蛋白质浓度(mg/mL),需要另外测定;V1:加入反应体系中粗酶液体积(mL),100μL=0.1 mL;T:催化反应时间(min),10min。
(2)按照样本质量计算
活性单位定义:37℃每克组织每分钟催化血红蛋白水解生成1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
胃蛋白酶活性(nmol/min/g鲜重)=C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×稀释倍数÷(W×V1÷V2)÷T=5500×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷W
C标准品:标准品浓度,0.5 μ mol/mL酪氨酸;稀释倍数:(100+500+500)÷100=11;W:组织质量(g);V1:加入反应体系中粗酶液体积(mL),100μL= 0.1 mL;V2:粗酶液总体积(mL),1mL;T:催化反应时间(min),10min。
注意事项
试剂三、试剂四、试剂五临用前配制,配制好用不完的试剂4℃可保存一周。
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