该试剂盒采用双重/多重荧光定量 RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）技术。
反转录（RT）：由于流感病毒是RNA病毒，试剂盒首先利用反转录酶将样本中的病毒RNA转化为互补DNA（cDNA）。
荧光PCR扩增：利用针对不同病毒亚型HA基因（血凝素基因）保守区域设计的特异性引物和探针（TaqMan探针），对cDNA进行扩增。
多通道检测：试剂盒通常使用不同的荧光染料（如FAM、VIC/HEX、CY5等）标记不同的探针。在PCR扩增过程中，仪器会实时监测不同通道的荧光信号增长情况，从而判断样本中是否含有上述四种病毒中的某一种或几种。
试剂盒组成
一个标准的50人份（50T）试剂盒通常包含以下组分（具体视厂家而定）：
组分名称 规格 (示例) 作用 保存条件
PCR反应液 500 μL (2×) 含dNTPs、Mg2、缓冲液 -20℃
酶混合液 50 μL 含逆转录酶、Taq DNA聚合酶 -20℃
引物/探针混合液 50 μL 针对pdmH1N1、H3N2、BV、BY的特异性引物和探针 -20℃
阳性对照 50 μL /管 (4管) 含各亚型病毒基因片段的质粒或灭活病毒 -20℃
阴性对照 100 μL 无菌水或缓冲液 2-8℃或-20℃
内标 (IS) 50 μL 用于监控样本采集、提取和扩增过程是否正常 -20℃
适用样本类型
呼吸道样本：鼻咽拭子、口咽拭子、鼻咽抽取物。
肺泡灌洗液 (BALF)：适用于重症或住院患者。
痰液：深部咳痰。
操作流程详解
第一步：样本采集与处理
使用无菌采样拭子采集受试者的鼻咽或口咽部分泌物。
将拭子头剪断或放入含有病毒保存液（VTM）的采样管中，充分震荡洗脱。
第二步：病毒RNA提取
从上述样本液中提取病毒RNA。可以使用磁珠法、柱提法或自动化提取仪进行提取。
注意：提取的RNA应尽快进行反转录，或置于-80℃保存。
第三步：PCR反应体系配置 (20 μL体系示例)
在冰浴上配制反应体系：
2× qPCR Mix: 10 μL
引物/探针混合液: 1 μL
酶混合液: 0.4 - 1 μL (视浓度而定)
模板RNA: 5 - 10 μL
无核酸酶水: 补足至20 μL
第四步：上机扩增与结果判读
反应程序：
逆转录：42℃ - 50℃ (30-60分钟)
预变性：95℃ (2-5分钟)
循环扩增：95℃ 15秒 → 60℃ 30-60秒 (采集荧光)，进行40-45个循环。
结果判读：
阳性：检测通道出现典型的“S”型扩增曲线，且Ct值 ≤ 35 (或厂家设定的阈值)。
阴性：无扩增曲线，或Ct值 > 40。
内标 (IS)：内标必须扩增正常（Ct值 < 35），说明样本采集、提取和扩增过程无抑制物干扰，结果才有效。
关键注意事项
防污染（重中之重）：
PCR实验室必须严格分区（试剂准备区、样本制备区、PCR扩增区），严禁人员和物品逆向流动。
每次实验必须设置阴性对照，以监控是否存在试剂或环境污染。
靶向HA基因的特殊性：
该试剂盒特异性检测HA基因。甲型流感病毒（H1N1和H3N2）的HA基因容易发生突变（抗原漂移）。如果病毒变异过大，导致引物或探针结合区域发生改变，可能会出现假阴性结果。
相比之下，检测甲流通用基因（如M基因）的试剂盒灵敏度通常更高，但无法区分H1N1和H3N2；而本试剂盒通过检测HA基因，实现了精准分型。
乙流的双系检测：
乙型流感病毒分为Victoria系（BV）和Yamagata系（BY）。这两系之间缺乏交叉免疫保护。该试剂盒能同时检测并区分这两系，对于流感的流行病学监测和疫苗株的匹配具有重要意义。
仅限科研或临床诊断：
购买时需注意试剂盒的注册证号。如果是“仅限科研”（RUO），则不能用于临床出具诊断报告；如果是“体外诊断”（IVD），则需在具备PCR实验室资质的医疗机构使用。
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