戊型肝炎病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒 新品

检验原理

染料法荧光检测：采用高灵敏度荧光染料（如 SYBR Green I）嵌入双链DNA，实时监测PCR扩增产物。

特异性引物设计：针对HEV保守区（如ORF2/ORF3基因区域）设计特异性引物，避免与其他肝炎病毒交叉反应。

一步法RT-PCR：整合反转录（RT）与实时荧光定量PCR（qPCR）于同一反应体系，简化操作流程。

绝对定量：通过标准品梯度稀释建立标准曲线，计算样本中HEV RNA拷贝数/浓度。

主要组分

| 组分名称 | 规格（48测试） | 储存条件 |

| HEV RT-PCR预混液（含染料/酶）| 1.2 mL | -20℃ 避光 |

| HEV特异性引物混合液 | 100 μL | -20℃ |

| HEV阳性标准品（10^6 拷贝/μL） | 50 μL | -20℃ |

| 核酸纯化阴性对照 | 200 μL | -20℃ |

| RNase-Free ddH₂O | 1 mL × 2 支 | 室温/4℃ |

适用仪器

兼容主流荧光定量PCR仪：

Bio-Rad CFX96, ABI 7500/QuantStudio, Roche LightCycler 480, 雅睿 MA-6000 等。

样本要求

适用样本类型：人血清、血浆、粪便、胆汁。

样本处理：建议使用商业病毒RNA提取试剂盒（如QIAamp Viral RNA Mini Kit）提取RNA，洗脱体积≤60 μL。

储存：提取后RNA立即使用或-80℃保存≤6个月。

检测流程

graph TB

  A[样本RNA提取] --> B[配制反应体系]

  B --> C[PCR扩增程序]

  C --> D[数据分析]

反应体系配制（20 μL体系）：

| 组分 | 体积 |

| RT-PCR预混液 | 10.0 μL |

| HEV引物混合液 | 2.0 μL |

| RNA模板 | 5.0 μL |

| RNase-Free ddH₂O | 补足至20 μL |

扩增程序：

| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 | 信号采集 |

| 反转录 | 50℃ | 15 min | 1 | 不采集 |

| 预变性 | 95℃ | 5 min | 1 | 不采集 |

| PCR扩增 | 95℃ | 10 sec | 40 | 不采集 |

| | 58℃ | 30 sec | | 采集 |

熔解曲线分析（推荐）：

95℃ 15 sec → 60℃ 1 min → 95℃ 15 sec（连续升温，0.5℃/sec）

结果判读

阴性对照（NTC）：Ct值≥38或无扩增曲线。

阳性对照：Ct值≤32（10^3 拷贝/μL）。

样本判读：

阳性：Ct值≤35，且熔解曲线峰值温度符合预期（如84±1℃）。

灰区：35<Ct值<38，建议复测。

阴性：Ct值≥38或无扩增。

性能参数

| 指标 | 性能要求 |

| 检测限（LoD） | 50 拷贝/mL（血清） |

| 线性范围 | 10^2~10^7 拷贝/mL |

| 重复性（CV%） | ≤5% |

| 特异性 | 不与其他肝炎病毒交叉 |

储存及运输

储存条件：-20℃避光保存（避免反复冻融≥3次）。

有效期：12个月（生产日期见外包装）。

运输条件：-20℃冰袋（干冰运输可选）。

注意事项

本试剂盒仅限科研使用，不可用于临床诊断。

严格分区操作：试剂配制区、样本处理区、PCR扩增区。

使用带滤芯吸头，避免气溶胶污染。

熔解曲线分析是验证扩增特异性的关键步骤！

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