商品属性
产品名称 | 单宁酶（TAN）测试盒 | 产品货号 | BH-961178 |
规格 | 100管/48样、50管/24样 | 产品分类 | 氧化与抗氧化系列 |
测试方法 | 微量法、紫外分光光度法 | 用途 | 仅供科研实验 |
测定意义与原理
测定意义
单宁酶（Tannase，EC 3.1.1.20）是一种水解酶，其测定具有重要的实际意义：食品工业：用于果酒、果汁加工，降低单宁含量，改善口感茶叶加工：提高茶叶品质，减少苦涩味，提高水溶性物质浸出率饲料工业：降低饲料中单宁含量，提高饲料营养价值环境保护：处理含单宁的工业废水，降低COD和BOD生物制药：用于生产没食子酸等医药中间体
测定原理
采用没食子酸标准曲线法，单宁酶催化单宁酸水解生成没食子酸和葡萄糖，在碱性条件下，没食子酸与福林-酚试剂反应产生蓝色化合物，在760nm处有最大吸收峰，吸光度与没食子酸含量成正比，间接反映单宁酶的活性。 单宁酸+H2O→单宁酶没食子酸+葡萄糖单宁酸+H2O单宁酶没食子酸+葡萄糖
试剂盒组成
组分 规格 作用说明
试剂A 液体30mL×1瓶 含0.1mol/L pH5.0醋酸盐缓冲液，提供酶促反应环境
试剂B 液体10mL×1瓶 含1%单宁酸溶液，酶促反应底物
试剂C 液体10mL×1瓶 含10%钨酸钠溶液，终止反应
试剂D 液体10mL×1瓶 含20%碳酸钠溶液，显色反应缓冲液
试剂E 液体5mL×1瓶 含福林-酚试剂，显色反应试剂
标准品 液体1mL×1支 含10mmol/L没食子酸标准品，用于建立标准曲线
自备仪器与试剂
必备仪器
分光光度法：可见分光光度计（760nm检测通道）、1mL玻璃比色皿
微量法：酶标仪（760nm检测通道）、96孔板
通用：低温离心机（≥8000g）、恒温水浴锅、可调式移液器、漩涡混匀器
必备耗材
离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器
自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水、酶提取液（0.1mol/L pH5.0醋酸盐缓冲液）
样本前处理方法
微生物发酵液样本取发酵液8000g 4℃离心10min，取上清液作为粗酶液直接测定若酶活性过高，用试剂A稀释1-10倍后测定样本可-20℃保存3个月，避免反复冻融
动植物组织样本取新鲜组织约0.1g，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分加入1mL酶提取液，冰浴匀浆8000g 4℃离心10min，取上清液作为粗酶液直接测定
食品样本茶叶：取干燥茶叶0.05g，加入1mL酶提取液，40℃水浴浸提30min果汁/果酒：取样本1mL，加入1mL酶提取液，振荡混匀8000g 4℃离心10min，取上清液作为粗酶液直接测定
化妆品/饲料样本取样本0.1g，加入1mL酶提取液，振荡混匀37℃水浴提取30min，期间振荡2-3次8000g 4℃离心10min，取上清液作为粗酶液直接测定
测定操作步骤
标准曲线建立将10mmol/L没食子酸标准品用蒸馏水稀释成0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mmol/L系列浓度取比色管，加入标准品溶液0.5mL + 试剂C 0.2mL + 试剂D 2.0mL + 试剂E 0.5mL，混匀37℃水浴反应30min，760nm波长下测定吸光度以没食子酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线
样本测定
酶促反应：
取比色管，加入样本0.5mL + 试剂B 0.5mL，混匀
37℃水浴反应30min，加入试剂C 0.2mL终止反应
空白管：加入样本0.5mL + 试剂C 0.2mL + 试剂B 0.5mL，同样处理
显色反应：
向反应管和空白管中加入试剂D 2.0mL + 试剂E 0.5mL，混匀
37℃水浴反应30min，760nm波长下测定吸光度
微量法操作取96孔板，加入样本25μL + 试剂B 25μL，混匀37℃恒温孵育30min，加入试剂C 10μL终止反应加入试剂D 100μL + 试剂E 25μL，混匀，37℃孵育30min酶标仪760nm波长下测定吸光度
结果计算方法
单位定义
U/mL：每毫升样本中，每分钟催化生成1μmol没食子酸的酶量
U/g：每克样本中，每分钟催化生成1μmol没食子酸的酶量
kat：每秒催化转化1摩尔底物的酶量（1kat=60×10⁶U）
计算公式
单宁酶活性(U/mL)=(A样−A空)×C标×V总(A标−A空标)×t×V样单宁酶活性(U/mL)=(A标−A空标)×t×V样(A样−A空)×C标×V总
A样-A空：样本扣除空白后的吸光度值
C标：标准品浓度（μmol/mL）
V总：酶促反应总体积（mL）
A标-A空标：标准品扣除空白后的吸光度值
t：反应时间（min）
V样：样本加入体积（mL）
简化公式
按体积计算：单宁酶活性（U/mL）= C标 × (A样-A空)/(A标-A空标) × V总/(t × V样)
按质量计算：单宁酶活性（U/g）= C标 × (A样-A空)/(A标-A空标) × V总/(t × W)
性能指标
指标 要求
线性范围 0~10mmol/L没食子酸当量，线性相关系数r≥0.995
最低检测限 ≤0.05U/mL
回收率 90%~110%
批内精密度 CV≤5.0%
批间精密度 CV≤8.0%
稳定性 2-8℃保存12个月，活性保留≥90%
注意事项
样本处理：
样本需新鲜制备，避免酶活性失活；-20℃可保存3个月
酶提取液需用pH5.0醋酸盐缓冲液，避免过酸或过碱影响酶活性
样本中不能添加重金属离子，以免抑制酶活性
试剂使用：
单宁酸溶液需现配现用，避免分解
福林-酚试剂需避光保存，避免氧化
不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线
测定过程：
反应温度需严格控制在37℃，反应时间30min
终止反应后需立即加入显色试剂，避免酶促反应继续进行
若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定
质量控制：
每次实验需设置空白对照和质控样本
定期校准仪器，确保检测结果准确性
若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确
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