商品属性
产品名称 | 硝酸还原酶(NR)测试盒 | 产品货号 | BH-961187 |
规格 | 100管/48样、50管/24样 | 产品分类 | 氮代谢系列 |
测试方法 | 微量法、可见分光光度法 | 用途 | 仅供科研实验 |
测定意义与原理
测定意义
硝酸还原酶（NR）是植物氮代谢中的关键酶，其测定具有重要的实际意义：植物生理学：决定植物氮素利用效率，影响作物产量和品质农业生产：合理施用氮肥，减少氮素损失和环境污染食品科学：评估蔬菜、水果等食品的营养品质生物技术：用于植物基因工程和代谢工程研究土壤科学：衡量土壤氮素转化能力和肥力水平
测定原理
NR催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，亚硝酸盐在酸性条件下与磺胺和α-萘胺反应生成紫红色偶氮化合物，在530nm处有最大吸收峰，吸光度与NR活性成正比。反应式如下： NO3−+NADH+H+→NRNO2−+NAD++H2ONO3−+NADH+H+NRNO2−+NAD++H2O
试剂盒组成
组分 规格 作用说明
试剂A 液体50mL×1瓶 含0.1mol/L pH7.5 Tris-HCl缓冲液，提供酶促反应环境
试剂B 液体10mL×1瓶 含10mmol/L硝酸钾溶液，酶促反应底物
试剂C 液体10mL×1瓶 含1%磺胺溶液，显色反应试剂
试剂D 液体10mL×1瓶 含0.1%α-萘胺溶液，显色反应试剂
试剂E 液体10mL×1瓶 含0.1mol/L盐酸溶液，显色反应缓冲液
标准品 液体1mL×1支 含100μmol/L亚硝酸盐标准品，用于建立标准曲线
自备仪器与试剂
必备仪器
分光光度法：可见分光光度计（530nm检测通道）、1mL玻璃比色皿
微量法：酶标仪（530nm检测通道）、96孔板
通用：低温离心机（≥8000g）、恒温水浴锅、可调式移液器、研钵/组织匀浆器
活体法：真空抽气装置、注射器
必备耗材
离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器
自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水、甲苯（不允许快递）
样本前处理方法
植物组织样本新鲜组织：准确称取0.1g植物组织，加入1mL提取液，冰浴匀浆细胞样本：收集500万细胞，加入1mL提取液，冰浴超声波破碎离心处理：12000g 4℃离心15min，取上清液置冰上待测样本稀释：若酶活性过高，用提取液稀释1-10倍后测定
土壤样本取土样：取5-10g新鲜土样，过2mm筛，去除石块和植物残体提取：加入5mL提取液，振荡30min，3000g离心10min过滤：取上清液用0.45μm滤膜过滤，滤液即为酶提取液保存：立即测定或-20℃保存3个月
测定操作步骤
分光光度法操作
酶促反应：
取比色管，加入样本0.5mL + 试剂B 0.2mL，混匀
37℃水浴反应30min，加入试剂C 0.2mL + 试剂D 0.2mL，室温显色15min
空白对照：取样本0.5mL + 试剂A 0.2mL，同样处理
吸光度测定：
在530nm波长下测定各管吸光度
以空白管调零，读取样本管吸光度值
活体法操作样本处理：将植物叶片放入注射器中，加入5mL试剂B，真空抽气5-10min反应：室温（25℃）反应30-60min，期间轻轻摇动数次检测：取反应液0.5mL，加入试剂C 0.2mL + 试剂D 0.2mL + 试剂E 0.2mL，显色15min测定：在530nm波长下测定吸光度值
结果计算方法
单位定义
U/g 鲜重：每克植物组织鲜重中NR酶的活性
U/L：每毫升发酵液/血清中NR酶的活性
U/g 干土：每克干土中NR酶的活性
计算公式
NR酶活性(U/g鲜重)=(A样−A空)×C标×V总(A标−A空标)×t×WNR酶活性(U/g鲜重)=(A标−A空标)×t×W(A样−A空)×C标×V总
A样-A空：样本扣除空白后的吸光度值
C标：标准品浓度（μmol/mL）
V总：样本提取液总体积（mL）
A标-A空标：标准品扣除空白后的吸光度值
t：反应时间（min）
W：样本质量（g）
土壤NR活性计算
土壤NR活性(U/g干土)=C×Vt×W×K土壤NR活性(U/g干土)=t×W×KC×V
C：亚硝酸盐浓度（mg/L）
V：反应液体积（mL）
t：反应时间（h）
W：干土质量（g）
K：土水比例
性能指标
指标 要求
线性范围 0~10μmol/L亚硝酸盐，线性相关系数r≥0.995
最低检测限 ≤0.01U/g鲜重
回收率 90%~110%
批内精密度 CV≤5.0%
批间精密度 CV≤8.0%
稳定性 2-8℃保存12个月，活性保留≥90%
注意事项
样本处理：
样本需新鲜制备，避免酶活性失活；-20℃可保存3个月
酶提取液需用pH7.5 Tris-HCl缓冲液，避免过酸或过碱影响酶活性
样本不能添加重金属离子，以免抑制酶活性
试剂使用：
磺胺和α-萘胺溶液需现配现用，避光保存
亚硝酸盐标准品需低温避光保存
不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线
测定过程：
反应温度需严格控制在37℃，反应时间30min
显色反应后需立即测定，2小时后吸光度值会下降
若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定
质量控制：
每次实验需设置空白对照和质控样本
定期校准仪器，确保检测结果准确性
若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确
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