背景[1-3]
人N端中段骨钙素(N-MID-OT）ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人N端中段骨钙素（N-MID-OT）水平。用纯化的人N端中段骨钙素（N-MID-OT）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入N端中段骨钙素（N-MID-OT），再与HRP标记的N端中段骨钙素（N-MID-OT）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的N端中段骨钙素（N-MID-OT）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人N端中段骨钙素（N-MID-OT）浓度。
人N端中段骨钙素(N-MID-OT）ELISA试剂盒操作流程
1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
应用[4][5]
用于QOA-8a抗骨质疏松活性研究
骨质疏松症(Osteoporosis,OP)是一种低骨量疾病,其最常见的原因是骨吸收增加,而骨形成不能相应增加以充分补偿骨吸收的增加。其常见的表现形式有：骨量减少、骨微结构破坏、骨强度降低、骨脆性增加、易骨折等等。骨质疏松症在中老年患者,特别是妇女中表现尤为明显,这与绝经后雌激素水平降低密切相关。骨质疏松治疗一般从促进骨形成——增加成骨细胞数量与活性,及抑制骨吸收——减少破骨细胞数量与活性两方面入手。
方法：1、体外培养人源成骨细胞hFOB1.19,以2nM,20nM,200nM,20μM的QOA-8a持续作用48h后,分别以MTT法测定化合物对细胞增殖活性的影响,同时测定作为成骨细胞功能及分化指标的碱性磷酸酶(ALP)的含量。分离人外周血单核细胞(PBMC),以TNF-a,RANKL及M-CSF联合诱导,过程中分别以20nM,50nM,200nM,2μM,20μM的QOA-8a进行干预,14d后,进行TRAP染色,对诱导成功的破骨细胞计数。
2、以0.1,1,5,10,20mg/kg/d的QOA-8a对三周的ICR小鼠进行右侧颅骨皮下注射。连续注射10天,取左右颅骨进行染色观察。利用双侧卵巢摘除两个月后的雌性SD大鼠,设置假手术、溶剂组、阳性药、0.1mg/kg/d,1mg/kg/d,1Omg/kg/d的QOA-8a实验组别,连续灌胃60d,进行子宫切片、观察骨微观结构、骨生物力学特性分析、血清N端中段骨钙素(N-MID-OT)、Ⅰ型原胶原氨基端前肽(PINP)等指标检测。
参考文献
[1]Quinoxaline derivative of oleanolic acid inhibits osteoclastic bone resorption and prevents ovariectomy-induced bone loss[J].Yu Zhao,Yue Huai,Jie Jin,Mei Geng,Jian-Xin Li.Menopause.2011(6)
[2]Serum N‐terminal osteocalcin is a good indicator for estimating responders to hormone replacement therapy in postmenopausal women[J].Jui‐TungChen,KenjiHosoda,KatsuhikoHasumi,EtsuroOgata,MasatakaShiraki.J Bone Miner Res.2009(11)
[3]Activation of p38 Mitogen‐Activated Protein Kinase and c‐Jun‐NH2‐Terminal Kinase by BMP‐2 and Their Implication in the Stimulation of Osteoblastic Cell Differentiation[J].JGuicheux,JLemonnier,CGhayor,ASuzuki,GPalmer,JCaverzasio.J Bone Miner Res.2009(11)
[4]Glycoside modification of oleanolic acid derivatives as a novel class of anti-osteoclast formation agents[J].Jun-Feng Li,Song-Jie Chen,Yu Zhao,Jian-Xin Li.Carbohydrate Research.2009(5)
[5]怀悦.QOA-8a抗骨质疏松活性研究[D].南京大学,2012.