多克隆抗体制备服务的应用

背景^[1-3]

多克隆抗体制备服务是根据要求制备多克隆抗体的技术服务，免疫物种采用SPF级兔，大鼠，小鼠和豚鼠等。可使用小分子、多肽、修饰多肽、蛋白、融合蛋白、修饰蛋白等作为抗原进行多克隆抗体制备，制备的多克隆抗体能够用于Western Blot，ELISA，和IHC等多种应用。

原理：当机体受到抗原刺激后,产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白(免疫球蛋白)，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。抗体的特异性取决于抗原分子的决定簇,各抗原分子具有许多抗原决定簇。因此,由它免疫动物所产生的抗血清实际上是多种抗体的混合物,称为多克隆抗体。相对于单抗来说，它能识别多个抗原表位。由于具有可识别多个表位、可引起凝集反应、沉淀反应等优点，被广泛应用于免疫学诊断领域。

多克隆抗体制备

服务流程：

1.提供抗原，纯度需>85%，浓度>0.5 mg/mL，至少1.5 mg；

2.免疫2只FPS动物，共进行3次免疫；

3.采集1mL免疫前血清，作为阴性对照；

4.采集免疫后2只FPS动物的多抗血清，分别进行ELISA效价检测试验；

5.提供ELISA检测报告和1ml免疫前血清。

应用^[4][5]

用于人EGFL6的重组表达，鉴定，纯化及多克隆抗体制备研究

通过克隆EGFL6全长及片段基因，构建pET32a（+）-EGFL6全长及片段蛋白原核表达载体，诱导表达并鉴定全长EGFL6蛋白及片段蛋白，并利用EGFL6片段蛋白免疫制备抗EGFL6多克隆抗体，应用其检测人肿瘤细胞系中EGFL6全长蛋白，为深入研究EGFL6的相关功能奠定了基础。

方法:（1）全长人EGFL6基因的亚克隆与原核表达：以本实验室保存的EGFL6载体质粒为模板PCR扩增EGFL6全长基因，将其连接到pMDTM18-T经克隆，测序，酶切鉴定正确后连接至表达载体pET32a（+）上，转化到克隆菌株以及表达菌株，同样通过双酶切鉴定正确后,进行诱导表达，SDS-PAGE及Western blot的方法检测和鉴定目的蛋白的表达。

（2）肿瘤细胞株中EGFL6的表达检测，从8株不同肿瘤及正常细胞系中提取总RNA，经反转录成cDNA后，利用实时荧光定量PCR方法检测8株细胞系中EGFL6基因的表达水平。

（3）肿瘤细胞株中EGFL6基因片段的克隆与表达：以表达水平最高的一株细胞cDNA为模板进行PCR扩增EGFL6片段基因，将其连接到pMDTM18-T载体上经克隆,测序和酶切鉴定正确后连接至表达载体pET32a（+）上，转化克隆菌株Ecoli.DH5α及表达菌株E coliRosetta-gami B，同样通过双酶切鉴定正确后,进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blot鉴定目的蛋白的表达。

（4）EGFL6片段的纯化、多克隆抗体的制备与检测：目标蛋白经大量表达后，利用镍离子亲和树脂进行纯化EGFL6片段蛋白，以纯化产物为完全抗原免疫昆明小鼠制备抗EGFL6的多克隆抗体，该多克隆抗体经辛酸-硫酸铵法沉淀后纯化后，作为抗体对A375，SKOV3及HUVEC细胞裂解物进行Western blot检测分析。

参考文献

[1]High-yield production,purification and characterization of functional human duodenal cytochrome b in an Escherichia coli system[J].Wen Liu,Gang Wu,Ah-Lim Tsai,Richard J.Kulmacz.Protein Expression and Purification.2011(1)

[2]EGFL6 is increasingly expressed in human obesity and promotes proliferation of adipose tissue-derived stromal vascular cells[J].Rupert Oberauer,Wolfgang Rist,Martin C.Lenter,Bradford S.Hamilton,Heike Neubauer.Molecular and Cellular Biochemistry.2010(1)

[3]Epidermal growth factor-like domain 7（EGFL7）modulates Notch signalling and affects neural stem cell renewal.[J].Schmidt Mirko H H,Bicker Frank,Nikolic Iva,Meister Jeannette,Babuke Tanja,Picuric Srdjan,Müller-Esterl Werner,Plate Karl H,Dikic Ivan.Nature cell biology.2009(7)

[4]VE-statin/egfl7 regulates vascular elastogenesis by interacting with lysyl oxidases.[J].Lelièvre Etienne,Hinek Aleksander,Lupu Florea,Buquet Christelle,Soncin Fabrice,Mattot Virginie.The EMBO journal.2008(12)