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左旋肉碱的纯化方法和含量检测

发布日期:2021/8/16 16:09:30

背景及概述[1]

左旋肉碱(L-carnitine),也叫L-肉碱,音译卡尼丁,是一种促使脂肪转化为能量的类氨基酸,是乳粉中一种营养成分,因其是一种类维生素营养素,也将其命名为维生素Bt。

含量检测[1]

1、试剂准备

高氯酸溶液(13%):13mL高氯酸稀释至100mL。

氢氧化钠溶液(10mol/L):称取40g氢氧化钠用水溶解,冷却后稀释至100mL。

氢氧化钾溶液(4.0mol/L):称取22.4g氢氧化钾用水溶解,冷却后稀释至100mL。

显色储备液:分别称取50mg2-硝基苯甲酸、5.96gN-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、185mg乙二胺四乙酸二钠溶于30mL去离子水中,用10mol/LNaOH溶液调pH至7.4~7.6,然后用水定容至50mL。此液置于4℃冰箱中可保存3个月。

显色工作液:吸取5.0mL显色储备液用水定容至25mL。

乙酰辅酶A(AcetylCoA)溶液:20.0mg乙酰辅酶A溶于2.0mL水中。临用时配制。

乙酰肉碱转移酶(CAT)溶液:吸取10μL乙酰肉碱转移酶悬浮液,经1500r/min离心10min,弃去上层清液,沉淀用0.2mL水溶解。临用时配制。

左旋肉碱标准品,sigma,纯度99%。配制成5个浓度备用,现配现用,分别是1.6,3.2,6.4,9.6,16ug/ml。

2、仪器

分析天平:万分之一。

pH计:精度0.01。

离心机:转速≥1500r/min。

恒温水浴锅:温度可控制在40℃±2℃。

酶标仪405nm及配套的96孔酶标板。

3、样品处理

准确称取2.5g混合均匀的试样于带刻度的50ml离心管中,用15mL40℃温水溶解。加入5mL13%高氯酸溶液,混合均匀后静止20min。用蒸馏水定容至刻度,混匀,用定量滤纸过滤。

取滤液20mL,用4mol/L氢氧化钾溶液调pH为12.5~13.0后,置于40℃水浴60min。冷却后用13%高氯酸调pH为7.0~7.5。将样液转入50mL容量瓶中,用蒸馏水定容。混匀后置于4℃冰箱中过夜。将试样处理液从冰箱中取出放置至室温,取上清液测定。

4、分析测定

在酶标板上设置标准孔5个(1.6,3.2,6.4,9.6,16)和样品孔,最好双孔平行测试;

取200ul标品或样品加入到相应的微孔中;

加入80ul底物到各个孔,加入10ul辅酶A到各个孔。轻轻混匀,立刻开始计时5分钟,室温;

在405nm读取吸光度OD1;

每孔加入10ul转移酶溶液,混匀(轻轻搅拌效果好),计时10分钟,室温;

用酶标仪405nm测试吸光度OD2。

5、结果计算

用吸光度差(OD2-OD1)作纵坐标,浓度值为横坐标,作图,从图中读出样品浓度,乘以稀释倍数(稀释倍数50)得最终结果。

纯化方法[2]

取100g左旋肉碱粗品于100mL添加0.1%甲酸甲酯的甲醇中,于-30℃下搅拌1小时使之混合均匀,过滤,除去不溶于该有机溶剂的沉淀物,并用贮藏于0℃下的甲醇洗涤沉淀物3次,滤液合并入左旋肉碱溶液,真空减压浓缩除去有机溶剂,即得左旋肉碱纯品。

经检测,该左旋肉碱产品化学纯度为97%。

参考文献

[1][中国发明]CN201810498612.6一种乳粉中左旋肉碱含量的检测方法

[2][中国发明]CN201510850786.0一种左旋肉碱粗品的纯化除盐方法

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