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左旋肉碱的制备和含量检测

发布日期:2021/2/26 11:38:38

背景及概述[1]

左旋肉碱或L-肉碱,别称L-肉毒碱或维生素BT,其化学名称为β-羟基γ-三甲铵丁酸,是一种白色晶状体或白色透明细粉。肉碱的研究始于20世纪初期。1905年,俄国人Gulewitsch和Krimberg从肉类提取物中发现了L-肉碱。自此以后,各国科学家进行了深入的研究,早期的研究发现,L-肉碱是一种类维生素营养素,并将其命名为维生素BT。而事实上,肉碱的化学结构类似于胆碱,与氨基酸相近;另外,由于一些动物可由自身合成来满足肉碱的需要,因此认为肉碱不是维生素,但习惯上仍将其称为维生素BT。实验表明L-肉碱是一种必需营养素,1985年在芝加哥召开的国际营养学术会议上,将左旋肉碱指定为“多功能营养品”。

制备[1]

步骤1:催化剂[RuCl(cymene)(S-BINAP)]Cl的制备。

取市场上采购的手性配体S-BINAP(0.535g,0.85mmol)和钌化合物[Ru(p-cymene)Cl2]2(0.29g,0.47mmol)于三颈瓶中,在N2保护下加入无水乙醇60mL和CH2Cl220mL,升温至50-60℃搅拌反应20h,减压除溶剂后,得0.87g红棕色产物[RuCl(cymene)(S-BINAP)]Cl[氯代[(S)-(-)-2,2′-双(二苯基膦)-1,1′-联萘](p-伞花素)氯化钌(II)]。

步骤2:中间体(R)-(-)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的制备。

取80g的4-氯乙酰乙酸乙酯于装备聚四氟衬管的高压釜中,将高压釜封闭好后,用5kgf/cm2的纯H2(99.99%)洗高压釜10余次后,向高压釜中充氢待用。在H2气氛下将催化剂[RuCl(cymene)(S-BINAP)]Cl(30mg)溶解于300mL的乙酸乙酯溶液中,用注射器小心将其加入高压釜中,继续充氢至5kgf/cm2后,升温至80℃左右,静置约20min后,开始搅拌,在此温度下反应6h后,停止反应,取出物料后经减压蒸馏除去低级烷基酯类溶剂即得高纯度产品。经GC分析产物。转化率大于99%,ee值96%。

步骤3:左旋肉碱的制备。

取上述产物-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(4.5g)于圆底烧瓶中,加入33%Me3N20mL,用翻口橡皮塞密封,升温至80℃,搅拌反应5h,停止反应,减压蒸馏除去未反应的Me3N后,加入10%的盐酸溶液40mL,继续在100℃下搅拌反应6h,冷至室温,加入CH2Cl220mL,室温下搅拌过夜,分离收集水溶液,真空旋干,得棕褐色粘稠状粗产物。

取预先制备好的阴离子交换树脂约200-300mL,参照硅胶湿法装好树脂柱,在顶层小心放置一层玻璃纤维,将上述粘稠状粗产物倒入装好的柱中,用去离子水淋洗,控制滴液速度大约为1-2mL/min,当流出溶液的pH>8时开始收集,收集至流出液的pH约为8时停止收集。将所得的溶液减压抽干。用乙醇/丙酮(1/7)重结晶,得到无色针状晶体(左旋肉碱),将所得肉碱产品于60-80℃下真空干燥1-2小时即得纯品,产量4.0g,收率为86%。测定上述所得产品的比旋光度为,[α]D23-30.1。

含量检测[2]

1、试剂准备

高氯酸溶液(13%):13mL高氯酸稀释至100mL。

氢氧化钠溶液(10mol/L):称取40g氢氧化钠用水溶解,冷却后稀释至100mL。

氢氧化钾溶液(4.0mol/L):称取22.4g氢氧化钾用水溶解,冷却后稀释至100mL。

显色储备液:分别称取50mg2-硝基苯甲酸、5.96gN-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、185mg乙二胺四乙酸二钠溶于30mL去离子水中,用10mol/LNaOH溶液调pH至7.4~7.6,然后用水定容至50mL。此液置于4℃冰箱中可保存3个月。

显色工作液:吸取5.0mL显色储备液用水定容至25mL。

乙酰辅酶A(AcetylCoA)溶液:20.0mg乙酰辅酶A溶于2.0mL水中。临用时配制。

乙酰肉碱转移酶(CAT)溶液:吸取10μL乙酰肉碱转移酶悬浮液,经1500r/min离心10min,弃去上层清液,沉淀用0.2mL水溶解。临用时配制。

左旋肉碱标准品,sigma,纯度99%。配制成5个浓度备用,现配现用,分别是1.6,3.2,6.4,9.6,16ug/ml。

2、仪器

分析天平:万分之一。

pH计:精度0.01。

离心机:转速≥1500r/min。

恒温水浴锅:温度可控制在40℃±2℃。

酶标仪405nm及配套的96孔酶标板。

3、样品处理

准确称取2.5g混合均匀的试样于带刻度的50ml离心管中,用15mL40℃温水溶解。加入5mL13%高氯酸溶液,混合均匀后静止20min。用蒸馏水定容至刻度,混匀,用定量滤纸过滤。

取滤液20mL,用4mol/L氢氧化钾溶液调pH为12.5~13.0后,置于40℃水浴60min。冷却后用13%高氯酸调pH为7.0~7.5。将样液转入50mL容量瓶中,用蒸馏水定容。混匀后置于4℃冰箱中过夜。将试样处理液从冰箱中取出放置至室温,取上清液测定。

4、分析测定

在酶标板上设置标准孔5个(1.6,3.2,6.4,9.6,16)和样品孔,最好双孔平行测试;

取200ul标品或样品加入到相应的微孔中;

加入80ul底物到各个孔,加入10ul辅酶A到各个孔。轻轻混匀,立刻开始计时5分钟,室温;

在405nm读取吸光度OD1;

每孔加入10ul转移酶溶液,混匀(轻轻搅拌效果好),计时10分钟,室温;

用酶标仪405nm测试吸光度OD2。

5、结果计算

用吸光度差(OD2-OD1)作纵坐标,浓度值为横坐标,作图,从图中读出样品浓度,乘以稀释倍数(稀释倍数50)得最终结果。

本方法对国标法进行了改进,使得左旋肉碱测定更加快捷方便。一是本方法所用到的试剂属于酶类制剂,价格比较高,用酶标板孔进行反应所需的试剂量是原来的十分之一,可以大大节约关键试剂的用量及成本。二是本发明方法可以一次性测试96孔的吸光度,节省很多时间,而分光度计每次只能测一个样的吸光度值,因而能达到一个快速检测的目标,例如测定10个样品时,本发明方法相对国标法可以节省210分钟。

参考文献

[1][中国发明,中国发明授权]CN201210089733.8一种左旋肉碱的制备方法

[2][中国发明]CN201810498612.6一种乳粉中左旋肉碱含量的检测方法

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