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《食品科学》:湘潭大学化工学院李路博士等:盐酸小檗碱抑制指状青霉的作用机制

发布日期:2022/4/13 10:41:29

由指状青霉引起的绿霉病是柑橘果实采后主要病害之一。目前,柑橘绿霉病的防控手段以化学杀菌剂为主,但化学杀菌剂引起的环境、安全及病原菌耐药性等问题日益严峻,因此筛选高效的绿色植物源杀菌剂具有重要意义。近年来,植物次生代谢产物生物碱对植物病原真菌的抑制作用引起了广泛关注。

小檗碱是异喹啉类生物碱,盐酸小檗碱(BH)具有广谱抑菌性,因其多靶位抑菌机制,使致病菌不易产生耐药性,常作为抗肿瘤、抗炎、抗菌成分应用于临床制剂。对植物病原真菌的抑制作用已有初步报道。湘潭大学果蔬贮藏与加工团队林 波、欧阳秋丽、李 路*等人对盐酸小檗碱抑制指状青霉的作用机制进行初步探讨,为柑橘采后绿霉病的防治提供理论依据。

01BH对指状青霉生长情况的影响

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PDB培养2 d后,BH浓度为0.16 g/L时可完全抑制指状青霉的生长,表明BH抑制指状青霉菌丝体生长的MIC值为0.16 g/L;将BH浓度≥MIC的培养液涂布到PDA平板继续培养2 d后发现,0.32 g/L BH可以完全抑制指状青霉的生长,表明MFC值为0.32 g/L。

不同浓度BH处理后,指状青霉的孢子萌发率均有所下降(图1)。对照组指状青霉孢子在6 h开始萌发,此时,BH 处理组的孢子均不萌发。15 h时,对照组孢子萌发率达92.48±3.35%。而0.5 MIC和1.0 MIC BH处理组的孢子萌发率分别为12.55±0.71%和4.40±1.05%,显著低于对照组(P<0.05)。表明BH可显著抑制指状青霉孢子的萌发。

02BH对柑橘果实绿霉病发病进程的影响

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BH对柑橘果实绿霉病发病进程的影响如图2所示。接种指状青霉3 d后,对照组柑橘果实开始发病,并表现出明显病症,贮藏5 d后全果腐烂。而经5 × MFC、10 × MFC BH处理的柑橘果实第4 d才开始发病,贮藏5 d后,10 × MFC BH处理的果实病斑直径为1.13 ± 0.02 cm,显著小于对照组(5.62±0.09 cm,P<0.05)(表2)。说明BH处理延缓了柑橘果实绿霉病的发病进程,且抑制作用呈浓度依赖性。

03BH对指状青霉菌丝体表面形态的影响

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BH处理对指状青霉菌丝体表面形态的影响如图3所示。120 min时,对照组菌丝体表面形态饱满完整,无褶皱凹陷(图3A);而0.5 MIC BH处理组部分菌丝体呈干瘪、褶皱、扭曲状(图3B);1.0 MIC BH处理组菌丝的损伤程度更加明显(图3 C)。表明BH可破坏指状青霉菌丝体表面形态,且处理浓度越大,菌丝体的损伤程度越明显。

04BH对指状青霉菌丝体细胞壁完整性的影响

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指状青霉菌丝体经CFW染色后,1.0 MIC BH处理组的荧光强度随处理时间的延长逐渐减弱,而对照组菌丝体的荧光强度基本不变(图4A)。其中,30 min时,1.0 MIC BH处理组的荧光值为初始值的0.93±0.00倍,显著低于对照组(1.00±0.01,P<0.05,图4B),说明此时细胞壁完整性已受损。AKP存在于细胞壁和细胞膜之间,细胞壁受损将导致AKP泄漏,因此进一步测定胞外AKP活力的变化对细胞壁受损情况进行验证。结果显示,30 min时,1.0 MIC BH处理组的胞外AKP活力为4.58±0.31 U/L,显著高于对照组(3.68±0.09 U/L,P<0.05)(图4B)。说明1.0 MIC BH处理30 min时,细胞壁完整性已受损,导致AKP从细胞周质空间释放到胞外。

05BH对指状青霉菌丝体细胞膜完整性的影响

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结果表明,30 min时1.0 MIC BH处理的菌丝体呈现明显的红色荧光,其荧光倍数为初始值的1.24±0.02倍,显著高于对照组(1.02±0.05,P<0.05),且荧光强度随处理时间的延长而增大,而对照组未观察到红色荧光(图5A-B)。进一步测定胞外电导率及可溶性蛋白的含量对细胞膜通透性的变化进行验证。发现30 min时,0.5 MIC BH和1.0 MIC BH处理组的胞外电导率相对初始增量和可溶性蛋白含量均显著高于对照组(P<0.05),且随处理时间延长,胞外电导率相对初始增量和可溶性蛋白含量持续增加(图5C-D)。说明0.5 MIC BH处理30 min时,坏指状青霉菌丝体的细胞膜通透性已受损,导致内容物泄漏。值得注意的是,30 min时,0.5 MIC BH处理组的细胞膜通透性已受损,而该浓度下细胞壁完整性受损发生在30 min之后,说明细胞膜是BH最初的作用位点。

06BH对指状青霉菌丝体胞内ROS和MDA水平的影响

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结果如图6所示。30 min时,BH处理组的胞内ROS和MDA含量与对照无显著性差异;而60 min时,1.0 MIC BH处理组ROS含量为初始值的1.040±0.027,胞内MDA含量增加至0.171±0.007 nmol/g prot,均显著高于对照组(P<0.05)。说明60 min时,1.0 MIC BH处理组的指状青霉菌丝体胞内ROS积累并发生膜脂过氧化反应。

07BH对指状青霉线粒体膜电位及能量代谢的影响

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由图7A可知,30 min时,BH对指状青霉菌丝体MMP没有造成显著影响,但处理60 min时,0.5 MIC和1.0 MIC处理组的菌丝体MMP分别为0.388±0.017、0.262±0.010,均显著低于对照组(0.435±0.013,P<0.05)。说明此时,线粒体功能已受损。此外,BH处理对指状青霉菌丝体的能量代谢造成显著影响。处理30 min时,菌丝体ATP含量迅速减少,0.5 MIC和1.0 MIC BH处理组的ATP含量分别为72.91±2.85 μg/g和76.16±0.87 μg/g,均显著低于对照组(116.52±5.18 μg/g,P<0.05);处理60 min时,ATP含量进一步下降(图7B)。胞内能荷也呈现类似变化趋势(图7C)。结果暗示BH处理30 min时,指状青霉菌丝体能量代谢已受影响,可能与细胞膜通透性的改变有关;60 min时,线粒体功能受损,能量代谢进一步失衡。

结论

BH能有效抑制指状青霉的孢子萌发和菌丝生长,并延缓柑橘果实绿霉病的发病进程。BH损伤病原菌的细胞通透性,导致胞内物质泄漏和能量失衡。随后,胞内ROS积累造成膜脂过氧化和线粒体损伤,进一步影响能量代谢,导致细胞凋亡。

本文《盐酸小檗碱抑制指状青霉的作用机制》来源于《食品科学》2022年43卷3期213-220页,作者:林波,欧阳秋丽,余婷,郑佳佳,陶能国,李路。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210305-068。

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