背景[1-3]
HUVEC人脐静脉内皮细胞来源于人静脉内皮，可在半固体培养基中形成克隆，在免疫抑制小鼠中不能形成肿瘤。
细胞接收后的处理：
1）请先在显微镜下确认细胞生长状态，酒精消毒瓶壁并将T25瓶置于37℃培养约2-3h。
2）弃去T25瓶中的培养基，添加6ml完全培养基。
3）如果细胞长满80%-90%请及时进行细胞传代。
HUVEC人脐静脉内皮细胞
细胞培养步骤：
培养基及培养冻存条件准备：
1）准备ECM培养基；优质胎牛血清，5%；添加对应因子；双抗，1%。
2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。
细胞处理：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加6mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜。第二天检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含6ml培养基瓶中。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
应用[4][5]
用于CGF对共培养人骨髓间充质干细胞与人脐静脉内皮细胞促成骨成血管作用及相关机制研究
通过体外细胞共培养实验,研究浓缩生长因子（concentrated growth factors,CGF）对共培养人骨髓间充质干细胞（human bone marrow-derived mesenchymal stem cells,h BMSC）和人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）增殖以及成骨成血管分化能力的影响,并对CGF促共培养细胞成骨作用的机制进行初步探索。
方法:（1）抽取健康志愿者血液制备富血小板血浆（platelet-rich plasma,PRP）、富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin,PRF）、CGF,通过酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测不同富血小板衍生物中主要生长因子血小板源性生长因子-BB（platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB）、转化生长因子-β1（transforming growth factor beta 1,TGF-β1）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的浓度。
（2）通过流式细胞术检测h BMSC表面特征性标志;在诱导h BMSC成骨、成脂分化后,通过染色检测其成骨、成脂分化能力。
（3）利用流式细胞术检测2%、5%、10%、20%CGF对共培养h BMSC和HUVEC细胞增殖的影响。
（4）利用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色以及实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR）检测2%、5%、10%、20%CGF对直接共培养h BMSC和HUVEC成骨相关基因（ALP、OCN、COL-1、RUNX2）,成血管相关基因（CD31、ANG2、v WF、KDR、VEGF）以及CX43基因的表达。并通过免疫荧光染色验证了h BMSC和HUVEC间连接蛋白43（connexin 43,CX43）的存在。
（5）通过Transwell小室间接共培养h BMSC和HUVEC,分析直接、间接共培养条件下成骨以及CX43基因的差异。
（6）使用TGF-β1通路抑制剂阻断TGF-β1信号通道,使用外源性重组TGF-β1生长因子作用于直接共培养h BMSC和HUVEC,利用q RT-PCR检测共培养h BMSC和HUVEC成骨分化程度,探索CGF中的TGF-β1在直接共培养h BMSC和HUVEC成骨分化中的作用。
结果:（1）成功获得PRP、PRF、CGF。通过ELISA检测到CGF中含有更多的PDGF-BB、TGF-β1、VEGF。
（2）所购h BMSC形态特征符合骨髓间充质干细胞形态特征,具有良好的成骨、成脂分化能力,流式细胞术检测到细胞表面CD44阳性、CD105阳性、CD45、CD31阴性,可用于后续实验。
（3）hBMSC和HUVEC以1:2比例直接共培养时,细胞培养第7、10、14天两者细胞数量均大致一致。当h BMSC和HUVEC以1:2比例直接共培养第7天时,在不同浓度CGF作用下,h BMSC数量随CGF浓度增高而增多。在低于5%CGF浓度条件下,HUVEC数量随着CGF浓度的增加而增多,而相对于不含CGF直接共培养组中的HUVEC,高于5%CGF浓度条件下,HUVEC增殖水平随着CGF浓度的增加而降低。
参考文献
[1]TGF-β1 facilitates cell-cell communication in osteocytes via connexin43-and pannexin1-dependent gap junctions.[J].Liu Wenjing,Zhang Demao,Li Xin,Zheng Liwei,Cui Chen,Cui Yujia,Sun Jianxun,Xie Jing,Zhou Xuedong.Cell death discovery.2019(1)
[2]Concentrated Growth Factors Can Inhibit Photoaging Damage Induced by Ultraviolet A（UVA）on the Human Dermal Fibroblasts In Vitro.[J].Chen Junyin,Jiao Dandan,Zhang Meng,Zhong Shihong,Zhang Tai,Ren Xiangyu,Ren Guiyun.Medical science monitor:international medical journal of experimental and clinical research.2019
[3]The potential application of concentrated growth factor in regenerative endodontics.[J].Hong S,Li L,Cai W,Jiang B.International endodontic journal.2019(5)
[4]Platelet-rich plasma,a powerful tool in dermatology.[J].Merchán William H,Gómez Lina A,Chasoy María E,Alfonso-Rodríguez Camilo A,Mu?oz Ana L.Journal of tissue engineering and regenerative medicine.2019(5)
[5]方悠然.CGF对共培养人骨髓间充质干细胞与人脐静脉内皮细胞促成骨成血管作用及相关机制研究[D].福建医科大学,2021.