背景[1-3]
粪便基因组DNA快速提取试剂盒适用于从粪便样本中提取总DNA，包括细胞、细菌、寄生虫以及病毒DNA，也适用于含有高浓度PCR反应抑制剂的样本。本品可处理多至300 mg的粪便样本，纯化获得主要为20-30 kb的DNA片段，纯化过程中不需苯酚或氯仿等有毒溶剂，无需乙醇沉淀，可在一小时内获得高纯度的DNA。
本试剂盒采用独特的缓冲系统使裂解液中的DNA高效结合到吸附柱上，同时粪便中的蛋白杂质及抑制下游反应的其他有机化合物可流过膜，PCR和酶反应的抑制剂以及残留的杂质可通过两步洗涤步骤有效去除，最后使用低盐缓冲液或水洗脱，即可获得高纯度DNA。纯化得到的DNA可以直接用于酶切、PCR、Real-Time PCR、文库构建、Southern Blot、分子标记等下游实验。
粪便基因组DNA快速提取试剂盒
操作步骤：
1.准备工作:取TE buffer,加至蛋白酶K中,充分混匀,配制成20mg/ml的白酶K溶液,可分装成小份,20保存1年有效。
2.取菌液置于EP管中,离心,弃上清液。再次加入1.5m菌液,重复该步骤一次。
3.加入Eco裂解液和3μl白酶K溶液(20mg/ml),充分混匀,37℃孵育1h。
4.加入CTAB沉淀液,充分混匀,65℃孵育10min
5.加入780蛋白清除液,充分混匀,12000g离心5~10min
6.转移上清至新EP管中,加入2倍体积的Eco漂洗液,混匀,20℃放置30min或过夜。
7.13000g离心10min,弃上清液,加入70%乙醇洗涤沉淀
8.13000g离心10min,弃上清液,室温干燥DNA沉淀,加入100或适量TE buffer溶解沉淀,20℃保存。TE buffer体积越大,DNA浓度越低。
应用[4][5]
用于基于LFD-RPA的主要肠道血吸虫核酸快速可视化检测方法的建立及初步评价研究
结合侧流层析试纸条（Lateral flow dipstick,LFD）和重组酶聚合酶扩增（Recombinase polymerase amplification,RPA）方法,建立能简单、快速识别日本血吸虫、曼氏血吸虫核酸的可视化检测技术,初步评价其对血吸虫中间宿主或终宿主感染早期的检测价值,并通过试剂、时间的折算,分析成本投入情况。
方法:以日本血吸虫SjR2和SjG55A作为靶基因,结合Primer Premier 5软件及手工辅助设计引物,通过简易检出限、特异性确定引物序列,初步建立RPA检测方法。以RPA检测为基础,设计探针,确定反应条件,初步建立LFD-RPA检测方法。以PCR方法为平行对照,评价建立检测方法的最低检出限、敏感性、特异性及不同终止方式检测结果。
制备不同比例混合的阳性钉螺和阴性钉螺基因组,评价LFD-RPA方法的最低检出混合度。分别取毛蚴感染后不同时期钉螺样本,用解剖镜检法判断钉螺感染情况,提取钉螺样本DNA,评价LFD-RPA方法对钉螺不同感染阶段的血吸虫核酸检测能力,进行RPA、PCR的平行检测。
LFD-RPA方法检测现场采集的钉螺样本,RPA、PCR为平行对照,评价LFD-RPA方法的检测效果。以曼氏血吸虫SmCOX1为靶基因,结合Primer Premier 5软件、手工辅助设计筛选引物,确定最终引物序列,初步建立RPA检测方法。以RPA检测为基础,设计探针,确定反应条件,初步建立LFD-RPA检测方法。
以文献中针对曼氏血吸虫Sm1-7基因设计的引物为基础,设计特异性探针,探索反应温度及时间,建立LFD-RPA检测方法。以PCR为平行对照,评价建立方法的最低检出限及与特异性。建立40尾、80尾曼氏血吸虫尾蚴梯度感染小鼠的动物模型（简称“40尾组”、“80尾组”）,并于感染后不同时间收集小鼠粪便及血清,提取DNA,用PCR、RPA、LFD-RPA方法进行平行检测,全面评价LFD-RPA方法检测曼氏血吸虫早期感染的效能。
随后,收集本实验室常用的血吸虫核酸检测生物学技术的基础数据,包括需要的试剂盒或主要试剂的具体名称、单盒价格、单盒反应次数以及来源。计算不同检测方法的每个样本投入成本,包括每个样本检测所需的试剂成本、劳动力成本。以每个样本投入试剂成本、劳动力成本为基础,在设置阴参、阳参的单个样本检测情况下,计算每次检测投入试剂成本、劳动力成本。同时,将96个反应作为不同检测方法批量检测总量。
计算批量检测情况下,每个样本检测投入试剂成本、劳动力成本。并按照实验所需仪器数量将每种方法的技术要求划分为简单、一般、复杂、极复杂四个等级,对LFD-RPA和其他核酸检测方法的成本和技术要求进行比较分析。
结果:成功建立了以日本血吸虫SjR2、SjG55A为靶基因的LFD-RPA检测方法以及以曼氏血吸虫SmCOX1、Sm1-7为靶基因的LFD-RPA检测方法,各方法的反应参数均为39℃、20min。冰上静置、滴加DNA提取液或酚氯仿三种终止LFD-RPA反应的方式对检测结果无影响。
以SjR2、SjG55A为靶基因建立的LFD-RPA方法对含有日本血吸虫靶基因的质粒和成虫基因组最低检出限分别为1copies/μl、102copies/μl和1fg/μl、10fg/μl,SjR2-LFD-RPA更佳,优于对应RPA、PCR方法。SjG55A-LFD-RPA方法与曼氏血吸虫、阳性双脐螺、埃及血吸虫、华支睾吸虫、大片吸虫、卫氏并殖吸虫基因组DNA均无交叉反应。
SjR2-LFD-RPA方法和埃及血吸虫、华支睾吸虫、大片吸虫、卫氏并殖吸虫基因组DNA无交叉反应,但可检出曼氏血吸虫、阳性双脐螺,提示与曼氏血吸虫有交叉反应。SjR2-LFD-RPA、SjG55A-LFD-RPA分别能最低检出2000只、1500只阴性钉螺中的1只阳性钉螺,最低检出混合度均高于对应RPA、PCR。SjR2-LFD-RPA、SjR2-RPA、PCR方法均可检出20组1:50的混合阳性钉螺,3中方法的敏感性均为100%。
参考文献
[1]Diagnosis of Schistosoma mansoni infections:what are the choices in Brazilian low-endemic areas?[J].Silva-Moraes Vanessa,Shollenberger Lisa M,Siqueira Liliane Maria Vidal,Castro-Borges William,Harn Donald A,Grenfell Rafaella Fortini Queiroz E,Rabello Ana Lucia Teles,Coelho Paulo Marcos Zech.Memorias do Instituto Oswaldo Cruz.2019
[2]Potential Impact of Climate Change on Schistosomiasis:A Global Assessment Attempt.[J].Yang Guo-Jing,Bergquist Robert.Tropical medicine and infectious disease.2018(4)
[3]Point-of-Care Periodontitis Testing:Biomarkers,Current Technologies,and Perspectives[J].Wanghong He,Minli You,Wanting Wan,Feng Xu,Fei Li,Ang Li.Trends in Biotechnology.2018
[4]Development of a lateral flow recombinase polymerase assay for the diagnosis of Schistosoma mansoni infections[J].Kate Poulton,Bonnie Webster.Analytical Biochemistry.2018
[5]王丽萍.基于LFD-RPA的主要肠道血吸虫核酸快速可视化检测方法的建立及初步评价[D].中国疾病预防控制中心,2021.