背景[1-3]
大鼠RAF-1蛋白激酶(RAF-1)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中大鼠Raf-1蛋白激酶（Raf-1）的含量。
实验原理：试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被大鼠Raf-1蛋白激酶（Raf-1）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的大鼠Raf-1蛋白激酶（Raf-1）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
大鼠RAF-1蛋白激酶(RAF-1)ELISA试剂盒
检测前准备工作：
1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。
2.从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象；放置室温，轻摇均匀，待结晶完全溶解后再配置洗涤液。可将20ml浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水稀释配置成400ml工作浓度的洗涤液，未用完的放回4℃
3.20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。
操作步骤：
1．从室温平衡60min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2．设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。
3．样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。
4．除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5．弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7．每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
实验结果计算：
绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。
应用[4][5]
用于Raf-1蛋白激酶及VEGF在大肠腺癌中的表达及临床意义的研究
研究大肠腺癌、大肠腺瘤和癌旁正常组织中Raf-1蛋白激酶和VEGF的表达及其临床意义。
方法收集72例大肠腺癌患者的手术切除标本共112份,其中取自癌组织72份,癌旁正常组织40份,收集40例大肠腺瘤患者的肠镜下切除标本,采用免疫组化法检测其Raf-1蛋白激酶及VEGF的表达。结果72例大肠腺癌组织中Raf-1蛋白激酶的阳性表达率为29.17%,VEGF的阳性表达率为41.67%,40例大肠腺瘤组织中Raf-1蛋白激酶阳性表达率为12.50%,VEGF阳性表达率为22.50%,40例癌旁正常组织中Raf-1蛋白激酶阳性表达率为2.50%,VEGF阳性表达率为10.00%,大肠腺癌Raf-1蛋白激酶及VEGF的阳性表达率均显著高于大肠腺瘤组织和癌旁正常组织（P<0.05）;大肠腺癌中Raf-1蛋白激酶的表达与患者的年龄、性别、病灶大小、分化程度、有无淋巴结转移、病灶浸润深度及Dukes分期均无关（P>0.05）;大肠腺癌中VEGF的表达与患者的年龄、性别、病灶大小、分化程度均无关（P>0.05）,但与肿瘤有无淋巴结转移、病灶浸润深度及Dukes分期均密切相关（P<0.05）。
结论Raf-1蛋白激酶及VEGF对大肠腺癌的发生、发展具有一定的促进作用,但Raf-1蛋白激酶在判断大肠腺癌浸润转移方面的意义尚不肯定。VEGF与大肠腺癌的血管生成密切相关,对大肠腺癌的生长和浸润转移具有肯定的促进作用。
参考文献
[1]The VEGF-C/Flt-4 axis promotes invasion and metastasis of cancer cells[J].Jen-Liang Su,Pan-Chyr Yang,Jin-Yuan Shih,Ching-Yao Yang,Lin-Hung Wei,Chang-Yao Hsieh,Chia-Hung Chou,Yung-Ming Jeng,Ming-Yang Wang,King-Jen Chang,Mien-Chie Hung,Min-Liang Kuo.Cancer Cell.2006(3)
[2]Comparative integromics on VEGF family members[J].Yuriko Katoh,Masaru Katoh.International Journal of Oncology.2006(6)
[3]High Prevalence and Possible de Novo Formation of BRAF Mutation in Metastasized Papillary Thyroid Cancer in Lymph Nodes[J].Vasily Vasko,Shuiying Hu,Guojun Wu,Jeffrey C.Xing,Alexandr Larin,Victoria Savchenko,Barry Trink,Mingzhao Xing.The Journal of Clinical Endocrinology＆Metabolism.2005(9)
[4]Regulation of vascular endothelial growth factor（VEGF）-C and VEGF-D expression by the organ microenvironment in human colon carcinoma[J].Seiji Onogawa,Yasuhiko Kitadai,Shinji Tanaka,Toshio Kuwai,Tsuyoshi Kuroda,Kazuaki Chayama.European Journal of Cancer.2004(10)
[5]李捷.Raf-1蛋白激酶及VEGF在大肠腺癌中的表达及临床意义[D].苏州大学,2007.