在免疫治疗过程中，细胞毒性T细胞(CTLs)在攻击肿瘤细胞中发挥重要作用。然而，复杂的肿瘤微环境（TME）可能极大地限制实体瘤内CTLs的活性和肿瘤杀伤功能，并促进各种免疫抑制细胞的肿瘤浸润。目前人们普遍认为，免疫抑制性TME是严重阻碍肿瘤免疫治疗应答的关键障碍之一。因此，通过各种途径调节TME被认为是提高各种癌症治疗，特别是癌症免疫治疗反应的一个有吸引力的策略。
苏州大学刘庄教授与苏州大学附属医院倪才方教授团队通过液相剥离法制备了氢化钙（CaH2）纳米颗粒，并首次将其应用于抗肿瘤治疗。纳米CaH2分散于低分子量聚乙二醇(PEG)中，注入肿瘤，与水发生反应，生成丰富的氢气(H2)、钙离子(Ca2+)和羟基离子(OH-)，分别实现氢治疗、肿瘤钙化和酸性TME中和。可注射的纳米CaH2分散体可显著抑制肿瘤生长。此外，纳米CaH2局部诱导肿瘤细胞凋亡和TME调控，可激活免疫系统，促进免疫细胞对肿瘤的浸润，与免疫检查点阻断共同作用，无需直接注射纳米CaH2即可引发强大的免疫反应，抑制远端的肿瘤。此外，纳米CaH2可分散于碘化油中获得CaH2-碘化油分散体用于介入经动脉栓塞(TAE)治疗兔肝癌模型，与单纯碘化油相比，TAE治疗兔肝癌的效果明显改善。这种通过纳米CaH2的方法可能成为未来临床应用的一种很有前景的抗肿瘤治疗药物，特别是通过干预治疗技术直接给药到肿瘤中。
纳米CaH2的制备与表征
CaH2纳米颗粒是通过典型的液相剥离法制备的。简而言之，将CaH2粉末在n-甲基吡咯烷酮(NMP)超声处理下分散20分钟。剥离后，得到纳米级CaH2颗粒，并通过离心纯化。从透射电子显微镜(TEM)成像来看，大尺寸的CaH2粉末可以被成功剥离成小的纳米颗粒，平均尺寸为7.9±1.7 nm。采用低分子量聚乙二醇(PEG 200)作为生物相容性溶剂分散和保护纳米CaH2，确保其进一步作为注射剂使用。研究了纳米CaH2分散体在不同水-乙醇溶液中的H2和Ca2+释放性能，纳米CaH2在无水乙醇中几乎不释放H2，而将水加入含有纳米CaH2的乙醇溶液中会产生大量H2。CaH2和H2O反应生成H2和Ca(OH)2，Ca(OH)2中和酸性缓冲液，pH值迅速增加。
图1：纳米CaH2的制备与表征图
CaH2诱导细胞凋亡的体外评价
探究了这种纳米CaH2是否会诱导细胞损伤和凋亡。根据标准的甲基噻唑基四唑(MTT)试验，当钙浓度超过0.6 mM时，纳米CaH2对小鼠乳腺癌(4T1)细胞和结肠癌(CT26)细胞的毒性比CaO更显著。纳米CaH2的细胞毒性可能归因于H2诱导的氢治疗和细胞内钙超载介导的细胞死亡。采用了一种商品化的JC-1线粒体染料，在对照组和CaO组中观察到微弱的绿色荧光，而纳米CaH2处理的细胞显示增强的绿色荧光，同时，CaH2组细胞内ATP含量也显著降低，说明生成的H2可以通过抑制线粒体功能，阻碍ATP合成来杀死癌细胞。还通过使用商业荧光Ca2+探针染色测量细胞内Ca2+水平，研究了细胞内Ca2+超载情况。CaH2和CaO组均表现出比对照组更强的绿色荧光，这是由于它们分解和有效释放外源游离Ca2+。同时，CaH2组比CaO组表现出更强的细胞内信号，这可能与释放的H2气体引起线粒体功能障碍，抑制细胞内Ca2+运输有关。
图2：纳米CaH2在体外诱导细胞凋亡
体内CaH2诱导癌症治疗
研究了纳米CaH2分散在聚乙二醇200对4T1荷瘤小鼠的治疗效果。与对照组相比，CaO仅能部分抑制肿瘤生长，而CaH2的抑瘤效果较明显。CaH2组小鼠的生存时间较对照组和CaO组明显延长。采用苏木素-伊红(H&E)染色和Ki67染色评价不同治疗后肿瘤切片的疗效。与肿瘤生长数据一致，与其他两组相比，纳米CaH2组的肿瘤损伤最为严重，进一步验证了其巨大的肿瘤杀伤效果。此外，在这样的处理后，没有观察到小鼠体重的显著变化，表明注射用纳米CaH2制剂的急性毒性可以忽略不计。
图3：体内CaH2诱导癌症治疗
小结
综上所述，首次通过液相剥离技术合成了纳米结构的氢化钙材料，并将其作为一种新型的抗癌剂应用且不会对身体产生任何长期的有害影响。这种纳米氢化钙可能成为未来临床应用的一种很有前途的抗肿瘤治疗药物，特别是通过干预治疗技术直接给药到肿瘤中。