背景[1-3]
结直肠腺癌细胞分离自一位72岁男性直肠原位癌，结直肠腺癌细胞系在标准培养条件下汇合后，自发分化为肠上皮样细胞，是常用的肠癌细胞模型。
结直肠腺癌细胞分离自直肠原位癌；当长到满时，结直肠腺癌细胞表现出特征性的肠上皮细胞分化。结直肠腺癌细胞表达维甲酸结合蛋白I和维甲酸结合蛋白Ⅱ，并呈角质蛋白阳性。
结直肠腺癌细胞
结直肠腺癌细胞处理：
1）复苏结直肠腺癌细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）结直肠腺癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁结直肠腺癌细胞，传代可参考以下方法：
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.收到结直肠腺癌细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，建议客户冻存一支备用，后续传代根据实际情况按1:2到1:5的比例进行。
3）结直肠腺癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
下面T25瓶为类；
1，结直肠腺癌细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2，4min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x10E6/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。
3，将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4][5]
结直肠腺癌细胞可以用于具核梭杆菌通过E-cadherin促进NCM460细胞增殖、迁移能力及炎症因子表达
了解具核梭杆菌对人正常结肠上皮细胞系有无影响作用,同时,想要通过本实验初步观察检测,正常肠道环境中出现具核梭杆菌感染后可能出现的细胞体液变化情况。
目前,国内关于人正常结肠上皮细胞系——NCM460细胞与具核梭杆菌间所发挥的相关作用机制的研究尚未见报道,本研究的研究目的为:1)建立具核梭杆菌与NCM460细胞共培养模型,了解其是否能对NCM460细胞的增殖活性、迁移能力及炎症因子的表达能力产生影响;
2) 具核梭杆菌是否通过NCM-460细胞表面E-钙黏蛋白/β-连环蛋白复合体的介导对细胞产生影响。
本研究以建立NCM460细胞与具核梭杆菌的共培养模型作为研究切入点,了解具核梭杆菌对人正常结肠上皮细胞有无影响作用,以及具核梭杆菌与NCM460细胞相互作用的具体机制,为进一步明确具核梭杆菌与结直肠疾病间的相关性提供理论和现实依据。
方法:本实验选取人正常结肠上皮细胞系即NCM460细胞与具核梭杆菌作为研究对象,将具核梭杆菌菌悬液与NCM460细胞分别稀释成不同浓度,以不同比例共培养,筛选出合适的细胞、细菌共培养比例,便于开展后续实验。
部分实验:1)细胞划痕实验检测NCM460细胞与具核梭杆菌共培养后,对细胞的迁移能力的影响,并设置大肠杆菌DH5α阳性对照组及空白对照组;
2)具核梭杆菌与NCM460细胞共培养一定时间后,利用细胞计数方法及CCK-8实验绘制细胞增殖曲线,了解细胞增殖活性改变情况,设置大肠杆菌DH5α阳性对照组及空白对照组;
3)NCM460细胞与具核梭杆菌共培养一定时间段,分别于不同时间点取出共培养样本通过流式细胞仪检测各实验组中不同细胞周期细胞数所占比例,分析各实验组中NCM460细胞通过细胞周期中的哪些增殖阶段,引起细胞增殖活性的变化;
4)收集NCM460细胞与具核梭杆菌共培养后的细胞蛋白,然后通过蛋白免疫印迹法,检测NCM460细胞中P-P56、IL-6、IL-1β、MMP-13的表达情况,了解NF-k B炎症通路的激活情况,以及下游炎症因子的变化。设置GAPDH作为内参对照。
之后收集NCM460细胞与具核梭杆菌共培养后的细胞蛋白,然后采用western-blot检测方法,观察细胞内E-钙黏蛋白、β-连环蛋白的表达变化情况,设置GAPDH作为内参对照;并利用显微镜观察细胞形态的改变,
采用E-钙黏蛋白si RNA或β-连环蛋白si RNA分别转染NCM460细胞,再通过细胞免疫荧光检测及Western-blot检测细胞内E-钙黏蛋白、β-连环蛋白的表达,确定转染成功;E-钙黏蛋白或β-连环蛋白沉默表达的NCM460细胞与具核梭杆菌共培养一定时间后,流式细胞仪检测各组细胞中细胞周期比例的改变,分析细胞增殖活性的具体细胞周期改变情况,并设置空白对照组;
E-钙黏蛋白或β-连环蛋白沉默表达的NCM460细胞与具核梭杆菌共培养一定时间后,采用q RT-PCR的检测方式及western-blot检测方法,了解NCM460细胞表达炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β、MMP-13的表达情况,GADPH作为内参对照,然后分析E-钙黏蛋白/β-连环蛋白在具核梭杆菌干预NCM460细胞过程中的参与机制。
参考文献
[1]Fusobacterium is associated with colorectal adenomas.[J].Amber N McCoy;;Félix Araújo-Pérez;;Andrea Azcárate-Peril;;Jen Jen Yeh;;Robert S Sandler;;Temitope O Keku.PLoS ONE,2017(1)
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[3]Fusobacterium nucleatum Promotes Chemoresistance to Colorectal Cancer by Modulating Autophagy[J].TaChung Yu;;Fangfang Guo;;Yanan Yu;;Tiantian Sun;;Dan Ma;;Jixuan Han;;Yun Qian;;Ilona Kryczek;;Danfeng Sun;;Nisha Nagarsheth;;Yingxuan Chen;;Haoyan Chen;;Jie Hong;;Weiping Zou;;Jing-Yuan Fang.Cell,2017(3)
[4]Invasive Fusobacterium nucleatum activates beta-catenin signaling in colorectal cancer via a TLR4/P-PAK1 cascade.[J].Chen Yongyu;;Peng Yan;;Yu Jiahui;;Chen Ting;;Wu Yaxin;;Shi Lei;;Li Qing;;Wu Jiao;;Fu Xiangsheng.Oncotarget,2017(19)
[5]马春婷.具核梭杆菌通过E-cadherin促进NCM460细胞增殖、迁移能力及炎症因子表达[D].武汉大学,2019.