水杨酸及其衍生物在医药、化工等领域应用广泛,但由于其有毒且自然降解时间长,会影响自然生态平衡和人类健康,因此,研究其降解方法对于实现绿色生产具有重要意义和必要性。而且,水杨酸及其衍生物的脱羧产物——苯酚及其衍生物,也是重要的有机化工原料,在化学工业、医药工业有着广泛的应用,既可作为化学合成的中间体,也是重要的化学药品原料。
4-氨基水杨酸在40℃以上的水溶液中不稳定,分解并放出二氧化碳而成为间氨基酚。现有技术中分解4-氨基水杨酸主要依靠加热手段,工厂化应用会耗费大量热能,并且随着逆反应的进行而使分解效率低下。
发明内容
为了解决以上技术问题,本发明采用的技术方案是:一种酶法降解4-氨基水杨酸的方法,包括以下步骤:
Ⅰ、提取并扩增水杨酸脱羧酶Sdc基因;在LB液体培养基中活化丝孢酵母并从丝孢酵母菌株中提取Sdc基因;经过PCR聚合酶链式反应扩增Sdc基因;
Ⅱ、制作含有Sdc基因的重组质粒;对PCR扩增后Sdc基因及载体质粒进行双酶切,并在DNA连接酶作用下16℃过夜培养,其中Sdc基因与载体质粒的体积比为3:1;
Ⅲ、构建Sdc大肠杆菌表达菌株,诱导表达;将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞中,37℃过夜培养;
Ⅳ、超声破碎Sdc大肠杆菌,纯化水杨酸脱羧酶;对Sdc大肠杆菌的二级种子液进行-80℃冰浴超声破碎制得粗酶液,其中,在100W条件下超声破碎3s,间歇3s,重复200个循环;粗酶液经0.45μm滤膜过滤,后通过镍柱纯化、透析得到水杨酸脱羧酶的精酶液;
Ⅴ、设置反应箱及反应体系;利用质谱法计算酶活;向反应箱中添加反应体系,包括1L PBS缓冲液、0.6~0.8g/L精酶液、0.1~0.3g/L氯化亚铁及 18~25g/L底物4-氨基水杨酸,并使反应体系的pH为4.0~5.0,温度为25~ 30℃;反应箱的上端设置排气口,排气口内安装抽气泵,将反应箱内的气体抽到外部环境中。
此方法的优势
本发明取代传统降解4-氨基水杨酸需经高温的技术条件,使分解反应更易进行且能耗更低、降解效率更高;利用基因工程使水杨酸脱羧酶的应用工业化,提高单位时间内的代谢产量;配制代谢效率最高的反应体系,反应体系中加入的氯化亚铁,在反应箱上设置抽气泵,可提高酶反应活性,并且防止逆反应的发生,提升分解效率;质谱法测量酶活相比现有技术的比色法更加准确。