背景[1-3]
A2780人卵巢癌细胞来自未治疗患者的肿瘤组织，是顺铂耐药细胞系A2780顺式和阿霉素耐药细胞系A2780 ADR的亲本株。该细胞系生长特性为贴壁细胞，细胞形态为上皮细胞样，生物安全等级为1，生长培养基为DMEM＋10%FBS＋1%P/S。
A2780人卵巢癌细胞
A2780人卵巢癌细胞培养操作
1）复苏A2780人卵巢癌细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）A2780人卵巢癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）A2780人卵巢癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；
1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。
3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4-5]
A2780人卵巢癌细胞可以用于大蒜素对人卵巢癌细胞株A2780的作用及机制
探讨大蒜素单独及联合顺铂对人卵巢癌细胞株A2780体外生长及凋亡的作用及机制。从而为临床减少化学药物剂量,减轻化疗的副反应提供充分实验室依据。
方法:1.采用MTT法检测不同浓度大蒜素联合顺铂依次应用对细胞增殖的影响。2.流式细胞仪分析不同浓度大蒜素联合顺铂依次应用对细胞凋亡的影响。
结果:1.倒置显微镜观察人卵巢癌细胞株A2780形态学变化
(1) 对照组:卵巢癌细胞A2780生长状态良好,细胞呈现铺路石状排列,伴随随时间推移,细胞接触紧密,并且增多。
(2) 大蒜素联合顺铂同时作用下卵巢癌细胞A2780组:24h时细胞形态无明显变化,细胞间开始出现细胞较明显的细胞间隙,少量细胞浆内出现空泡;72h时,未死亡细胞明显萎缩,胞间间隙明显增大,部分细胞可见碎裂的细胞核,而胞浆仍然完整。
(3) 大蒜素单独作用卵巢癌细胞A2780 24h后联合顺铂共同作用组:24h时卵巢癌细胞A2780生长状态良好;48h后,少部分胞浆内出现空泡,细胞间隙开始变大,部分死亡细胞可见碎裂的细胞核。
(4) 顺铂单独作用卵巢癌细胞A2780 48h后联合大蒜素共同作用组:24h时未见明显细胞间隙及萎缩;72h时加药培养液中可见大量死亡细胞悬浮,少数未死亡细胞核可见碎裂迹象,细胞萎缩明显。
2. 大蒜素联合顺铂对人卵巢癌细胞株A2780增殖抑制影响
(1) 大蒜素联合顺铂同时作用卵巢癌细胞组A2780:各检测时间下卵巢癌细胞A2780增殖抑制作用明显,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。大蒜素药液浓度为50mg/L时顺铂共同作用72h对卵巢癌细胞A2780增值抑制影响最显著,两药具有协同作用(q>1.15)。
(2) 大蒜素单独作用卵巢癌细胞A2780后24h后联合顺铂共同作用组:24h时卵巢癌细胞A2780出现轻度增殖促进,但差异无统计学意义(P>0.05);48h、72h时卵巢癌细胞A2780增殖抑制率不同程度提高(P<0.05)具有统计学意义。大蒜素药液浓度为100mg/L、50mg/L时,两药具有协同作用(q>1.15)。浓度为50mg/L的大蒜素与顺铂共同作用72h对卵巢癌细胞A2780增值抑制影响最显著。
(3) 顺铂单独作用卵巢癌细胞A2780 48h后联合大蒜素共同作用组:24h、48h时卵巢癌细胞A2780增殖抑制较稳定,与对照组相比(P<0.05)具有统计学意义;72h时各实验组卵巢癌细胞A2780增殖抑制作用显著提高(P<0.05)具有统计学意义。顺铂单独作用后联合浓度为50mg/L的大蒜素共同作用至72h时对卵巢癌细胞A2780增值抑制影响最显著,两药具有协同作用(q>1.15)。
3. 流式细胞仪检测大蒜素联合顺铂对人卵巢癌细胞株A2780凋亡影响
(1) 大蒜素联合顺铂同时作用卵巢癌细胞组:72h时各浓度药物作用下卵巢癌细胞凋亡率分别为17.85%、22.23%、14.84%、3.93%与对照组3.65%相比,差异具有统计学意义(p<0.05)。
(2) 大蒜素单独作用卵巢癌细胞后24h后联合顺铂共同作用组:72h时各浓度药物作用下卵巢癌细胞凋亡率分别为10.86%、11.98%、7.19%、3.92%与对照组3.74%相比,差异具有统计学意义(p<0.05)。
(3)顺铂单独作用卵巢癌细胞48h后联合大蒜素共同作用组:72h时各浓度药物下卵巢癌细胞凋亡率分别为23.47%、26.89%、23.97%、17.82%与对照组3.16%相比,差异具有统计学意义(p<0.05)。
参考文献
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[2]Down-regulation of the JAK2/PI3K-mediated signaling activation is involved in Taiwan cobra cardiotoxin III-induced apoptosis of human breast MDA-MB-231 cancer cells.Kuei-Li Lin;;Jung-Chen Su;;Ching-Ming Chien;;Pei-Wen Chuang;;Long-Sen Chang;;Shinne-Ren Lin.Toxicon,2010
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[5]宋霞.大蒜素对人卵巢癌细胞株A2780的作用及机制[D].泰山医学院,2012.