背景及概述[1]
DNA连接酶（EC6。5。1。1）用于体外DNA连接、连接检测PCR，体内冈崎片断连接成完整基因组DNA有重要作用。基因工程所用DNA连接酶由公司提供，最常用的是T4DNA连接酶（T4Lig）。因为应用广泛并由公司提供，较多科研人员常忽略对其性质的全面了解，导致体外平端DNA连接效率很低，转化中出很多问题。T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，在体外可在ATP辅助下，催化粘端或平端双链DNA或RNA的5′-P末端和3′-OH末端之间形成磷酸二酯键。由于T4DNA连接酶的连接特性，连接酶是DNA复制过程中复制链的合成所必需的，并参与DNA损伤修复以及染色体重组等重要生命过程的调节，广泛应用于分子克隆中重组DNA的构建等领域。然而目前此种工具酶严重依赖进口，各生产厂家随产品的说明书中规定的参数不统一，使得产品质量状况参差不齐，缺乏一个统一判定标准。
连接酶分子大小[1]
T4Lig由T4嗜菌体30基因合成，最早从T4嗜菌体感染的E。coli提取。后来发现DNA复制缺失型嗜菌体中连接酶产量更高，从而作为连接酶的主要来源，目前市场供应连接酶通过基因工程方法生产。Murry测定T4Lig分子量为63000~68000Da，Armstrong进一步确定为55，230Da，由487个氨基酸（Aa）残基组成，基因长度1464bp（GenBank序列号为X00039）。按照分子量与分子大小比例关系估算，T4Lig大小约3。4nm，可跨越约1个DNA双螺旋长度（即10bp）。连接酶占据连接端口下游（5’-P端部）7~10bp，占据端口上游（3’-OH端部）3~5bp。只有487Aa的酶分子同时具有连接活性，拓扑异构活性表明其结构、功能比较复杂。与之相比，E。coliDNA连接酶671Aa，分子量74000Da，每个E。coli细胞含有约300个DNA连接酶分子，与DNA聚合酶分子个数接近，可以满足DNA复制时冈崎片断连接需要，细菌和真核生物中冈崎片断长度分别为1000bp左右和100~200bp。
连接酶保真性[1]
相对于DNA聚合酶，连接酶保真性不太熟悉，特别是DNA体外连接的科研人员。连接酶保真性是指酶分子识别连接端口核苷酸的能力。T4Lig识别连接端口碱基能力较低，从而连接多种异常端口：3’或5’无嘌呤或无嘧啶碱基、缺失1nt的连接端口、3’和5’A-A或T-T配对、5’G-T配对、3’C-A、C-T、T-G、T-T、T-C、A-C、G-G、G-T配对。连接反应中加入亚精胺（spermidine）、高盐缓冲液，或降低连接酶用量可以提高T4Lig保真性。Wu等发现100nMDNA在1UT4Lig，200mM高盐浓度下保真性可提高60倍。随着保真性提高，Km增加4倍，Vmax降低~30倍。酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）DNA连接酶保真性较高，可识别1nt缺失端口和3’A-G或T-G配对端口，但是识别5’A-C、T-C、C-A、G-A匹配能力不高。5’-P端部核苷酸识别能力较低可能与5’-P-AMP复合物的形成有关。与常温作用的T4Lig连接酶（37℃）不同，有些高温作用的DNA连接酶：Pyrococcusfuriosu（sPfu）连接酶、Thermusaquaticus（Taq）连接酶、Thermusthermophilus（Tth）连接酶、Thermotogamaritima（Tma）连接酶。TaqDNA连接酶反应温度45~65℃，TmaDNA连接酶反应温度60℃。TaqDNA连接酶保真性比T4Lig、E。coliDNA连接酶高很多。TthDNA连接酶保真性比T4Lig高24倍。TthDNA连接酶具有3’-5’外切活性，可以切去与模板非匹配碱基。TthDNA连接酶的保真性较高，可能与TthDNA聚合酶3’-5’外切活性较低有关，高温菌T。thermophilusDNA合成中很少掺入错配碱基，需要TthDNA连接酶切去冈崎片断连接时错配碱基。TthDNA连接酶中K294R和K294P突变后，既保留了该酶的切口DNA连接活性，又提高了保真性约4倍和11倍。T4Lig识别错配碱基能力较低，可能与T4DNA聚合酶的3’-5’外切活性有关。
连接机理与结构[1]
目前DNA连接反应机理是基于切口双链DNA底物得到的：普遍认为连接反应由三步完成：①T4Lig先由ATP供能产生E-AMP复合物；②E-AMP复合物识别双链DNA切口位置，将AMP转移到5’-P基团，形成5’-P-AMP复合物；③3’-OH亲核攻击5’-P-AMP形成磷酸二酯键，并释放出AMP。在PDB数据库检测不到T4Lig的晶体结构，导致连接机理不完全明了，特别是平端DNA连接机理不完善。以热稳定性PfuDNA连接酶晶体结构为模板，笔者通过同源分子建模模拟T4Lig结构。显示出DNA连接酶有三个保守性结构域：DNA结合结构域DBD，腺苷酰化结构域AdD（adenylaitiondomain，I130~E368），寡核苷酸链结合结构域OBD（oligonucleotide-binding-fold，V369~E482）。腺苷酰化结构域AdD中K159是腺苷酰化位点，通过该位点形成N6-AMP-lysine酶-底物复合物。根据相似性比对发现，R164、R182、R359、K365是ATP结合位点，E217、E344二价金属离子结合位点（UniProtKB登录号：P00970）。
Rossi等切除T4LigN-端80个Aa、C-端57个Aa、C-端137个Aa分别得到NΔ80、C-Δ57、C-Δ137突变体，酶学性质表明N端80个Aa、C端57个Aa在DNA结合中起重要作用。模拟结构显示N端M1~L129是DBD结构域，C端V369~E482是OBD结构域，均与DNA结合有关。端部切除显示E-DNA复合物有两种状态：腺苷酰化酶分子复合物的短暂态：是指ATP将AMP转移到连接酶K159上形成E-AMP复合物；去腺苷酰化态酶分子复合物的稳定态（S·complex）：是指E-AMP复合物将AMP转移到连接端口5’-P基团形成5’-P-AMP复合物，需要寻找附近的3-OH，所以此时E-DNA复合物是一种稳定态，稳定态复合物与平端连接有关。K159是T4Lig酶分子腺苷酰化作用位点，K159L突变体表明K159不参与识别DNA、但是K159L突变后酶分子不能完成自身腺苷酰化。在AMP存在下，K159L突变体具有DNA内切活性，可以将超螺旋质粒DNA切成环状切口DNA，解除DNA超螺旋。
活力测定[3]
（1）酶活力测定。按表2配置连接反应体系，反应体系中以ddH2O代替待测酶设置空白对照，以加入能完全连接的酶量（15U/50μL）设置为阳性对照，电泳检测点入λDNA-HindIIIMarker作为分子量对照。
轻轻混匀，16℃反应30min，反应结束后65℃温浴10min，置于冰上。电泳观察连接情况，按连接情况加入酶的最小体积乘以稀释倍数计算酶活力。
（2）灵敏度。分别向连接体系中添加不同模板量，对该方法的模板灵敏度进行考察，按表3配制连接反应体系。
轻轻混匀，16℃反应30min，反应结束后65℃温浴10min，置于冰上。电泳观察连接情况，判断能检测到的连接最低模板量。
（3）重复性。按照表3（λDNA-HindIII加入量为1μg）配制连接体系，配制6个平行反应，16℃反应30min，反应结束后65℃温浴10min，置于冰上，电泳观察连接情况。
（4）稳定性。根据表3（λDNA-HindIII加入量为1μg）配制连接体系，配制2个平行反应，16℃分别反应30min，1，2，4h，连接过夜，电泳观察连接情况。
主要参考资料
[1] 卫生学大辞典
[2] T4 DNA 连接酶性质及其平端连接功能
[3] T4DNA连接酶性质及其平端连接功能