背景[1-3]
PKR抗体是一种非偶联的兔源性单克隆抗体，约为62 kDa，靶向PKR。它可用于WB、ICC/IF、IHC-P、IP检测，在人类背景下无标签。
PKR抗体
PKR抗体使用步骤（Western Blot）：
1.样本制备
1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。
2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。
3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
2.蛋白电泳
1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。
2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。
3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。
5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。
6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。
3.转膜与封闭
1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。
2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。
3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。
4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。
5）转膜结束后，切断电源，取出膜。
6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。
7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。
8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。
9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。
10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。
11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。
4.抗体孵育与检测
1）将膜和一抗（PKR抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。
2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(PKR抗体)。
3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。
4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。
5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。
6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。
7）显影曝光。
应用[4][5]
PKR抗体可以用于草鱼IRF9与STAT2结合上调IFN与PKR转录水平
克隆鉴定了草鱼IRF9的cDNA全长序列(KT601055)和STAT2的cDNA全长序列(KT781914)。草鱼IRF9 cDNA全长含有一个1287 bp的ORF,731 bp的3'UTR和49 bp的5'UTR序列。草鱼STAT2 cDNA全长有2913 bp,含有一个2550 bp的ORF,241 bp的3'UTR和122 bp的5'UTR序列。PKR抗体荧光定量PCR检测显示,草鱼IRF9和STAT2在草鱼脑、眼、鳃、皮、肠、肝、脾、肾各组织中的表达偏低,经poly I:C刺激后,草鱼IRF9和STAT2在各组织中的表达量均成显著性上升,但程度有所不同,其中IRF9在刺激48 h后肝组织中表达量达到最高值,而STAT2在肠组织中表达量达到最高。经LPS刺激后,除了皮肤组织,其余组织中IRF9的mRNA表达水平均有明显上调,且在刺激24 h后肝组织表达量达到最高值。然而草鱼STAT2经LPS刺激后,只有眼组织表达水平变化不明显,其余组织表达水平均有明显上调,在刺激24 h后肝组织表达量达到最高值。
通过体外非变性凝胶阻滞实验检测草鱼IRF9蛋白与IFN和PKR启动子的亲和性分析,结果显示草鱼IRF9蛋白能显著阻滞IFN和PKR启动子的移动,对IFN和PKR启动子具有强烈的亲和性,而草鱼IRF9的去N端截断蛋白对IFN和PKR的启动子移动情况阻滞效果不明显。同样,经过PKR抗体荧光素酶活性检测实验表明草鱼IRF9能显著上调IFN和PKR的启动子活性,而IRF9的截断蛋白却没有显示出明显的上调效果。这些实验表明草鱼IRF9能够上调IFN和PKR的转录表达,而草鱼IRF9的N端结构域对IFN和PKR的转录活性调节具有重要作用。
为验证草鱼IRF9/STAT2二聚体能够扮演ISGF3的角色激活ISGs基因的表达,我们将草鱼IRF9和STAT2一起共转染进HEK-293T细胞中,检测IFN和PKR启动子的转录活性。荧PKR抗体光素酶活性分析结果显示,共转染草鱼IRF9和STAT2靶基因启动子的荧光素酶活性明显高于单转草鱼IRF9和STAT2。并且经共转染IRF9和STAT2,细胞中的STAT1表达量变化不明显。为了进一步验证草鱼IRF9/STAT2二聚体的存在,我们分别进行了PKR抗体免疫共沉淀和GST-polldown实验。
将草鱼IRF9和STAT2分别构建到p3XFLAG-MycCMV?-24和pCMV-N-HA质粒上,瞬时共转染进HEK-293T细胞中,结果表明:草鱼IRF9能与STAT2发生相互作用。同样,草鱼STAT2的N端截断蛋白ST2-936-GST能够pulldown 293T细胞中的草鱼IRF9蛋白,表明草鱼STAT2能与IRF9直接发生相互作用。
参考文献
[1]Poly I:C facilitates the phosphorylation of Ctenopharyngodon idellus type I IFN receptor subunits and JAK kinase[J].Qunhao Hou;;Ruiyue Gong;;Xiancheng Liu;;Huiling Mao;;Xiaowen Xu;;Dan Liu;;Zao Dai;;Haizhou Wang;;Binhua Wang;;Chengyu Hu.Fish and Shellfish Immunology.2017
[2]The unique role of STAT2 in constitutive and IFN-induced transcription and antiviral responses[J].Katarzyna Blaszczyk;Hanna Nowicka;Kaja Kostyrko;Aleksandra Antonczyk;Joanna Wesoly;Hans A.R.Bluyssen.Cytokine&Growth Factor Reviews.2016
[3]Fish IRF3 up-regulates the transcriptional level of IRF1,IRF2,IRF3 and IRF7 in CIK cells[J].Xiaowen Xu;;Qinan Lai;;Meihui Gu;;Dan Liu;;Qunhao Hou;;Xiancheng Liu;;Yichuan Mi;;Zhicheng Sun;;Haizhou Wang;;Gang Lin;;Chengyu Hu.Fish and Shellfish Immunology.2015
[4]Noncanonical Effects of IRF9 in Intestinal Inflammation:More than Type I and Type III Interferons.[J].Rauch Isabella;;Rosebrock Felix;;Hainzl Eva;;Heider Susanne;;Majoros Andrea;;Wienerroither Sebastian;;Strobl Birgit;;Stockinger Silvia;;Kenner Lukas;;Müller Mathias;;Decker Thomas.Molecular and cellular biology.2015
[5]吴真.草鱼IRF9与STAT2结合上调IFN与PKR转录水平[D].南昌大学,2018.