酸性红 73(Acid red 73,AR73),俗称酸性大红GR,是一种化学合成的偶氦盐类染料，主要用于羊毛、丝织物及纸张、皮革的染色，还可用于塑料、电化铝、水泥的着色和染发产品之中。酸性红 73以致癌物质一对氨基偶氦苯为中间体,有中等毒性,强致癌性。2011年欧洲委员会已将酸性红 73列为禁用染发剂原料。酸性红 73能与人血清蛋白(HSA)、DNA结合,与其竞争具有重要生理功能的生物分子。另外，酸性红 73分子结构上有两个磺酸基,有报道称含硫染料具有遗传毒性。酸性红 73工业废水分解的有毒物质会危害到水生生物及动植物，因此，德国将其污染水的等级列为3级(WGK Germany 3)。目前,已建立了多种处理废水中酸性红 73的方法。由于酸性红 73染色效果好、不易褪色,有被非法添加于虾、肉等食品的蒸煮过程中的案例門,从而造成酸性红 73的残留。关于虾仁中酸性红 73染料的反向高效液相色谱法已有报道,但尚未有酸性红 73免疫学检测技术的相关报道。
实验方法
1、人工抗原的合成与鉴定
(1)称取1.2g酸性红 73,加入10 mL吡啶，完全溶解后，加入1.6g琥珀酸酐和20mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP),在80℃水浴搅拌3h;冷却至室温,调至pH3~4,在4°C静置过夜;以冰异戊醇重结晶3次,抽滤，真空干燥，即得粗制酸性红 73-半琥珀酸酯(AR73-HS),回收率为38.6%。(2)称取56mg酸性红 73-半琥珀酸酯，溶于1mL二甲基甲酰胺(DMF)中,加入20mg NHS和40mg DCC，在室温下搅拌活化过夜；取上清液缓慢滴加于3mL含有65mg BSA的PBS缓冲液中，在4°C低速搅拌过夜。(3)将反应液装入处理后的透析袋中，在4℃用生理盐水搅拌透析5d，换液10次，即得酸性红73-半琥珀酸酯-牛血清白蛋白(AR73-HS-BSA),用作免疫原，-20℃冻存。将BSA换成OA，以同种方法即得酸性红73-半琥珀酸酯-卵清蛋白(AR73-HS-OA),用作包被原。包被原和免疫原分别通过紫外光谱与SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定。
2、多克隆抗体的制备
选取3只健康纯种新西兰大白兔,免疫前采血作阴性对照。在兔皮内多点注射,免疫剂量为1mg/只,以皮下多点注射方式加强免疫4次。抗血清以饱和硫酸铵法纯化,粗提IgG组分。
3、间接竞争ELISA方法的建立及样品提取
采用方阵滴定法确定包被原和免疫原的最佳工作浓度，以此建立对酸性红 73的间接竞争ELISA检测方法，将酸性红 73分别换成同等系列浓度的苏丹红3号、番红花红、苯酚红、刚果红、碱性品红进行检测。将无竞争物时的OD值作为B0值，各浓度抑制时的OD值作为B值，以B/B0为纵坐标，各竞争物浓度的对数(lgC)为横坐标，绘制竞争抑制曲线。将产生50%和20%抑制时的竞争物浓度定义为本方法对竞争物的半数抑制浓度(IC50)和检出限(LOD),交叉反应率(CR)按酸性红 73 IC50与竞争物IC50的百分比计算。
4、样品的制备提取
选用已知未添加酸性红 73染料的虾仁作为空白样品，添加酸性红 73染料的标准品(添加浓度为10,30和100ng/g),用乙醇-氨水-水(7:3:1,V/V)的混合液提取，并进行空白样品的标准添加回收实验，评价本方法的准确性。
参考文献
[1]常向彩,杨晓农,宋定州,等. 酸性红73多克隆抗体的制备及其应用[J]. 分析化学,2012,40(10):1593-1597. DOI:10.3724/SP.J.1096.2012.20115.