背景[1-3]
人钙网蛋白(CRT)Elisa试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人钙网蛋白(CRT)水平。用纯化的人钙网蛋白(CRT)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入钙网蛋白(CRT)，再与HRP标记的钙网蛋白(CRT)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的钙网蛋白(CRT)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人钙网蛋白(CRT)浓度。
人钙网蛋白(CRT)Elisa试剂盒
人钙网蛋白(CRT)Elisa试剂盒样本处理及要求：
1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5.组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。
6.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。
7.不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
人钙网蛋白(CRT)Elisa试剂盒操作程序：
1.预先计算好所需的板条数，实验前30 min，拿出试剂盒，恢复至室温。
2.每个反应孔中加入100μl标准品工作液或检测样本（若样本浓度高于检测范围，需用标准品&样本稀释液稀释后取样），标准品需做复孔，封板后于37°C孵箱孵育90 min。
3.弃去液体，甩干，每个反应孔中加入100μl生物素标记瘦素抗体工作液至反应孔中，封板后于37°C孵箱孵育60 min。
4.洗涤：弃去液体，甩干，每个反应孔中加入350μl洗涤液，浸泡1-2 min，甩干洗涤液。重复4次。
5.每个反应孔中加入100μl HRP标记链霉亲和素工作液至反应孔中，封板后于37°C孵箱孵育30min。
6.洗涤：每个反应孔中加入300μl洗涤液，间隔30 s，甩干洗涤液。重复4次。
7.每个反应孔中加入90μl显色剂（避光）至反应孔中，封板后于37°C避光显色15 min左右。
8.每个反应孔中加入50μl终止液，即刻用酶标仪450 nm波长下测量OD值（5 min内）。
9.用酶标仪450 nm波长测定OD值。
10.计算标准品、样品的平均OD值：每个标准品和样本的OD值应减去零孔的OD值。
11.以标准品浓度为横坐标，吸光度OD值为纵坐标，用“四参数logistics模型”绘制标准曲线。
12.若样本OD值高于标准曲线上限，应做适当稀释后重新检测，计算浓度时再乘以稀释倍数。
应用[4][5]
人钙网蛋白(CRT)Elisa试剂盒可以用于联合免疫原性细胞死亡诱导剂和TLR9激动剂的全细胞肿瘤疫苗的抗瘤活性研究
构建一种联合化疗药物诱导的免疫原性细胞死亡和TLR9激动剂SD-101的全细胞肿瘤疫苗,检测其对树突状细胞的激活能力,分析其诱导的CD4+和CD8+T细胞应答,并评估其抗肿瘤活性。
方法:本论文以小鼠肺腺癌细胞系LLC为肿瘤研究对象,米托蒽醌（MTX）为ICD诱导型化疗药物的代表。采用系列浓度MTX处理LLC,利用流式细胞术分析LLC的死亡情况、钙网蛋白的暴露情况,验证MTX对LLC的ICD诱导,并确定MTX的最佳应用浓度。LLC经MTX诱导死亡获得垂死的LLC（MDL）,再通过体外共培养检测MDL单独或与SD-101联合使用对DC抗原吞噬和活化功能的影响。我们进一步利用足垫免疫模型分析MDL联合SD-101（以下简称MDLSD）在小鼠体内激活T细胞应答的能力。最后,建立小鼠肺腺癌模型,利用流式细胞术分析了MDLSD疫苗诱导的CD4+和CD8+T细胞应答;通过监测肿瘤的生长,绘制小鼠的肿瘤生长曲线、计算小鼠的无瘤率和生存周期,分析MDLSD疫苗的抗肿瘤的预防和治疗效应;监测小鼠体重变化,初步分析MDLSD疫苗的安全性。
人钙网蛋白(CRT)Elisa试剂盒结果:本论文通过细胞实验检测MTX诱导LLC死亡并上调了细胞膜表面钙网蛋白的表达,证实此诱导为ICD诱导。再通过DC共培养实验检测到MDL促进DC吞噬肿瘤细胞能力以及MDLSD促进DC活化。在T细胞刺激实验中,MDLSD显著促进IFN-γ的分泌。预防性肿瘤模型显示,MDLSD疫苗的保护率达100%,且这些无瘤小鼠体内产生了记忆CD4+和CD8+T细胞应答,二次免疫攻击实验显示这些记忆T细胞应答可提供长期免疫保护。
参考文献
[1]MyD88-dependent signaling drives toll-like receptor-induced trained immunity in macrophages[J].Owen Allison M.;Luan Liming;Burelbach Katherine R.;McBride Margaret A.;Stothers Cody L.;Boykin Olivia A.;Sivanesam Kalkena;Schaedel Jessica F.;Patil Tazeen K.;Wang Jingbin;Hernandez Antonio;Patil Naeem K.;Sherwood Edward R.;Bohannon Julia K..Frontiers in Immunology.2022
[2]Clinical advances and ongoing trials on mRNA vaccines for cancer treatment[J].Lorentzen Cathrine Lund;Haanen John B;MetÖzcan;Svane Inge Marie.The Lancet Oncology.2022
[3]Cancer vaccines:the next immunotherapy frontier[J].Lin Matthew J.;Svensson Arvelund Judit;Lubitz Gabrielle S.;Marabelle Aurélien;Melero Ignacio;Brown Brian D.;Brody Joshua D..Nature Cancer.2022
[4]A Therapeutic Whole-Tumor-Cell Vaccine Covalently Conjugated with a TLR7 Agonist[J].Chi Huju;Hao Yue;Wang Xia;Tang Li;Deng Yongqiang;Chen Xianxiong;Gao Feng;Sha Ou;Jin Guangyi.Cells.2022
[5]牟漫.联合免疫原性细胞死亡诱导剂和TLR9激动剂的全细胞肿瘤疫苗的抗瘤活性研究[D].武汉科技大学,2024.