背景[1-3]
普氏立克次体(RP)核酸检测试剂盒(荧光-PCR法)采用TaqMan探针法实时荧光PCR技术，针对普氏立克次体基因高度保守区设计一对特异性引物和探针，利用相应仪器对PCR过程进行实时监测，实现检测结果的定性分析，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。
斑疹伤寒是由普氏立克次体（R.prowazekii）或莫氏立克次体（R.mooseri）引起的急性感染性疾病，普氏立克次体引起的感染称为流行性斑疹伤寒，而莫氏立克次体引起的称为地方性斑疹伤寒。流行性斑疹伤寒为虱传播，临床症状较重，主要表现为高热、头痛、皮疹，甚至神经性症状显著，可出现听觉障碍、神志迷糊直至死亡。目前,普氏立克次体的临床诊断主要依靠血清学检测,但是由于特异性抗体出现较晚,故无法在早期对该病进行诊断。培养分离方法操作复杂和耗时，而且成功率不高。普通PCR法显得不敏感，加上PCR法的其它缺陷,使得普氏立克次体的PCR检测难以在临床上推广使用。实时荧光定量PCR是一种快速检测病原体的高特异和高敏感技术。
普氏立克次体(RP)核酸检测试剂盒(荧光-PCR法)利用实时荧光定量PCR原理，定性检测普氏立克次体，对普氏立克次体的诊断及疗效评估有重要指导意义。
普氏立克次体(RP)核酸检测试剂盒(荧光-PCR法)
适用仪器:ABI、安捷伦MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf等系列荧光定量PCR检测仪。
样本类型:适用于血液、体液和棉拭子等多种样本。
保存和运输:采集或处理好的样品在2℃~8℃条件下保存应不超过24 h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不超过3次。
普氏立克次体(RP)核酸检测试剂盒(荧光-PCR法)操作流程（以荧光PCR为例）
1.样本处理：血液、体液和棉拭子样本取100μL于1.5mL灭菌离心管中。
2.试剂配制：加入预混反应液、酶及模板，离心混匀。
3.扩增检测：运行预设程序（如：95℃预变性2min，95℃15s→60℃30s，45循环），分析Ct值。
结果判读
阳性：检测通道Ct值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线；
阴性：样本检测结果Ct值>40或无Ct值。
严格质控标准：每批次试剂通过灵敏度、重复性、特异性验证。
应用[4][5]
普氏立克次体(RP)核酸检测试剂盒(荧光-PCR法)可以用于普氏立克次体120kDa表面蛋白基因的克隆与表达及重组蛋白抗原性的研究
在克隆与表达普氏立克次体的120kDa表面蛋白抗原特异性较好的N端部分和免疫反应性较好的C端部分的基因片段，并对表达的重组蛋白的抗原性进行研究。采用PCR方法，从普氏立克次体基因组中扩增到120kDa表面蛋白抗原N端基因片段和C端基因片段，将两个基因片段分别与原核表达载体pQE30连接，构建重组质粒pQE30／N和pQE30／C。将重组质粒转化大肠杆菌，并用IPTG诱导转化的大肠杆菌表达目的蛋白。SDS-PAGE鉴定pQE30／N转化菌表达的N端重组蛋白的分子量为26kDa，pQE30／C转化菌表达的C端重组蛋白的分子量为67kDa。免疫印迹分析证明N端重组蛋白和C端重组蛋白均能与普氏立克次体免疫血清特异反应，N端重组蛋白仅与立氏立克次体免疫血清发生交叉反应，C端重组蛋白则与立克次体属的多种立克次体免疫血清发生交叉反应。用ELISA分析重组蛋白与各种相关免疫血清的交叉反应，发现N端重组蛋白和C端重组蛋白与立克次体属内的立克次体免疫血清有较强的交叉反应，但是与贝氏柯克斯体、恙虫病东方体以及其它相关病原体免疫血清无交叉反应，提示N端重组蛋白和C端重组蛋白具有立克次体属特异性。
用N端重组蛋白免疫血清和C端重组蛋白免疫血清与各种相关病原菌抗原作间接免疫荧光分析，结果显示它们与立氏立克次体发生明显的交叉反应，而与其它立克次体的血清学交叉反应不明显。该结果提示该重组蛋白免疫血清可以用作检测普氏立克次体和立氏立克次体的特异性抗体。为了证明重组蛋白的免疫原性，用纯化的N端重组蛋白和C端重组蛋白免疫小鼠和家兔。采用间接免疫荧光和酶联免疫吸附实验检测免疫小鼠和家兔的血清特异性抗体水平，结果发现N端和C端重组蛋白均能有效地诱导小鼠和家兔产生较高水平的特异性IgG，C端重组蛋白刺激小鼠和家兔产生的体液免疫水平比N端重组蛋白的刺激水平高。两个重组蛋白分别对同源蛋白免疫小鼠和普氏立克次体全细胞抗原免疫小鼠的脾淋巴细胞进行体外刺激，均能诱导较高水平的淋巴细胞增殖。足垫肿胀实验提示C端重组蛋白能够诱导小鼠发生明显的特异性迟发型变态反应。采用普氏立克次体(RP)核酸检测试剂盒(荧光-PCR法)，分析普氏立克次体全细胞抗原免疫小鼠的脾脏T淋巴细胞被不同抗原刺激后是否表达细胞因子正N一Y、IL一2、IL一4和IL一10。普氏立克次体(RP)核酸检测试剂盒(荧光-PCR法)结果发现用N端重组蛋白刺激的小鼠脾淋巴细胞表达了IFN一丫和IL一2两种细胞因子，用C端重组蛋白刺激的小鼠脾淋巴细胞表达了正N一Y、IL一2和IL一4三种细胞因子。
参考文献
[1]Characterization of rickettsial adhesin Adr2 belonging to a new group of adhesins inα-proteobacteria[J].Manohari Vellaiswamy;;Malgorzata Kowalczewska;;Vicky Merhej;;Claude Nappez;;Renaud Vincentelli;;Patricia Renesto;;Didier Raoult.Microbial Pathogenesis,2011(5)
[2]Real‐Time PCR Duplex Assay for Rickettsia prowazekii and Borrelia recurrentis[J].J.U.JIANG;JOSEPH J.TEMENAK;ALLEN L.RICHARDS.Annals of the New York Academy of Sciences,2008(1)
[3]A murine model of infection with Rickettsia prowazekii:implications for pathogenesis of epidemic typhus[J].Yassina Bechah;;Christian Capo;;Georges E.Grau;;Didier Raoult;;Jean-Louis Mege.Microbes and Infection,2007(7)
[4]Tropical rickettsioses[J].Philippe Parola;;Didier Raoult.Clinics in Dermatology,2006(3)
[5]高宁.普氏立克次体120kDa表面蛋白基因的克隆与表达及重组蛋白抗原性的研究[D].中国人民解放军军事医学科学院,2004.