雌二醇(estradiol,E2)是一种A环为苯环的18碳类固醇激素,分子量272.4Da,为人体雌激素(estrogen)的主要组成部分。雌二醇的合成呈周期性变化,能够促进女性生殖器官的形成及发育,第二性征的出现及维持,并与孕激素协同形成月经周期。此外,还具有广泛的代谢调剂作用。人雌二醇(E2)测定对评价各种月经异常是非常有用的指标,人雌二醇(E2)浓度检测可观察药物诱导排卵及促性腺激素的治疗。雌二醇(E2)增高见于多胎妊娠、卵巢癌、系统性红斑狼疮等;雌二醇(E2)降低见于妊娠高血压综合征、卵巢囊肿、葡萄胎、垂体卵巢性不孕等。因此，开发人雌二醇(E2)Elisa试剂盒可用于测定人血清、血浆及相关液体样本中雌二醇(E2)含量具有重要的意义。
人雌二醇(E2)Elisa试剂盒的制备
(1)抗E2的抗体包被板制备
a.包被:取1mol/L Na2HPO4 77.4ml和1mol/L NaH2PO4 22.6ml混匀,加入去离子水定容至1000ml即成10倍包被液,临用前稀释十倍,加入适量抗E2单抗(购买自Meridianlifescience)混匀,然后加入到微孔板板孔中，100ul/孔，4℃ 16小时;
b.封闭:弃去包被液,在吸水纸纸上拍干,加入含有3% BSA和0.05%防腐剂(ProclinTM300)的磷酸盐缓冲液(pH7.4)，200ul/孔，37℃ 2小时;
c.封袋:弃去封闭液,在吸水纸上拍干,室温下于真空干燥箱中抽5小时,立即进行真空封袋,检查有无漏气,如有重新封袋,贴上标签后于2-8°C保存。
(2)酶标记物的制备
用含有2.5%BSA 1.5%的脱脂奶粉和0.05%防腐剂(ProclinTM300)的磷酸盐缓冲液(pH7.4)配制缓冲系统。E2(购买自Meridian lifescience)用过碘酸盐氧化法与辣根过氧化物酶交联。
(3)E2校准品的制备
用含有3% BSA和0.05%防腐剂(ProclinTM 300)的磷酸盐缓冲液(pH7.4)配制缓冲系统。用E2纯品配制校准品工作液(E2纯品购买自Meridian lifescience),分别为0、25、100、250、500、1000pg/ml共6个浓度。
(4)E2质控品的制备
小牛血清与去离子水6:4混合,并添加0.05%防腐剂(ProclinTM 300),配制成质控品缓冲液。用E2纯品制备质控品工作液(E2纯品购买自Meridian lifescience)分装85.6pg/ml、917.5pg/ml。
(5)化学发光底物液的制备
使用PIERCE公司的SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate作为配套检测液。A液、B液各1瓶。
(6)20X浓缩洗涤液制备
取NaCl 170g吐温-20 10ml加水定容至1L即成，临用前稀释20倍。
(7)半成品及成品组成
上述步骤所得产品分装后即为半成品。抽检合格后组装成人雌二醇(E2)Elisa试剂盒成品，成品还需抽检，合格后才能出厂[1]。
人雌二醇(E2)Elisa试剂盒的使用
1.试剂和样本准备
(1)试剂准备
a.将人雌二醇(E2)Elisa试剂盒置室温(18-26℃)平衡20分钟。
b.从试剂盒中取出浓缩洗涤液,用新鲜的纯化水1:20稀释后加入洗板机的洗液瓶中。
(2)样本准备
使用前将待测的合格血清或血浆置室温(18-26℃)平衡20分钟。
2.操作步骤
取出所需的E2抗体包被微孔板置于微孔架上，加入校准品1-6、质控品1-2和待测样本,每孔20ul。加入酶标记物100ul/孔，轻柔震荡混匀，室温孵育35分钟。弃去孔内废液。手工洗涤:弃去孔内液体,洗涤液注满各孔、静置5秒，甩干，重复5次后拍干；洗板机洗涤：每孔350ul，重复4次，洗涤后拍干。加发光底物A、B每孔各50ul,充分混匀,立刻加入化学发光仪中检测信号值。
3.实验结果的计算
可以采用作图法或计算法进行结果计算
作图法:以标准品抗原含量的1g值为横坐标(X),以其对应的信号值为纵坐标(Y)绘制出标准曲线，然后根据人雌二醇(E2)Elisa试剂盒检测样本测得的信号值在标准曲线上查出相应的抗原含量1g值,再计算出抗原含量。
计算法:以标准品抗原含量的lg值为自变量(X),以其对应的信号值为因变量(Y),求出回归方程,将待测标本的信号值代入回归方程,求得相应的抗原含量[1]。
参考文献
[1]上海裕隆生物科技有限公司. 雌二醇化学发光定量检测试剂盒:CN200910200391.0[P]. 2011-06-15.