背景[1-7]
毒力因子qPCR检测是通过细菌RNA进行qPCR检测毒力因子关联基因的种类及表达水平已达到检测细菌毒力水平的目的。毒力因子是构成细菌毒力的物质，包括细菌毒素，粘附蛋白，细胞表面碳水化合物和保护细菌的蛋白质，以及可能有助于细菌致病性的水解酶等。微生物在特定物种的宿主病原菌之所有能感染宿主并且在宿主环境中繁殖，通常就是依靠一系列的毒力因子之间相互协调作用起作用。所以研究病原菌的毒力因子，对于了解病原菌和宿主之间的相互作用有非常重要的作用。
细菌的毒力因子组成：构成细菌毒力的物质称为毒力因子(virulent factor),主要有侵袭力和毒素。侵袭力：病原菌在机体内定殖,突破机体的防御屏障,内化作用,繁殖和扩散,这种能力称为侵袭力。毒素：细菌毒素按其来源、性质和作用等的不同,可分为外毒素和内毒素两大类.在大多数情况下,外毒素一般简称毒素。
毒力表示病原体致病能力的强弱，构成细菌毒力的物质称为毒力因子(virulent factor)，主要有侵袭力和毒素。病原菌在机体内定殖、突破机体的防御屏障、内化作用、繁殖和扩散，这种能力称为侵袭力。细菌毒素按其来源、性质和作用等的不同，可分为外毒素和内毒素两大类。在大多数情况下，外毒素一般简称毒素。病原菌之所有能感染宿主并且在宿主环境中繁殖，通常就是依靠一系列的毒力因子之间相互协调作用起作用。所以研究病原菌的毒力因子，对于了解病原菌和宿主之间的相互作用有非常重要的作用。
应用[8][9]
毒力因子qPCR检测可用于检测细菌毒力因子关联基因表达研究：
单增李斯特菌是一种重要的食源性致病菌,其导致食物中毒的首要条件是能够抵抗人体内恶劣的胃液环境。本实验以单增李斯特菌LM440、ATCC19115、ATCC19111和ATCC15313为受试菌,研究四株不同毒力及来源的受试菌对生长温度(0℃、4℃、7℃、22℃、37℃、45℃)、NaCl浓度(0、0.5%、1%、2%、4%、6%、8%、10%)、pH(4.5、5、6、7、8、9.5)的敏感性,在此基础上分析四株菌对人工胃液(pH=1.5、2.5、3.5)的耐受特性。
结果表明,四株菌对高、低温均具有一定的耐受性,不同温度迟滞时间从小到大依次为45℃<22℃<4℃<7℃;受试菌可生长的盐浓度范围是0～6%,而ATCC19115在8%的盐浓度下仍可缓慢生长;受试菌可生长的pH范围是5～9.5,此外,当pH=5时,LM440对酸的适应性显著地强于其它菌株(p<0.05);受试菌在人工胃液pH=3.5时,四株菌的存活率依次为LM440>ATCC19115>ATCC15313>ATCC19111;pH=2.5时,LM440和ATCC19115对人工胃液的耐受能力极显著地强于ATCC15313和ATCC19111(pp<0.01);pH=1.5时,四株受试菌均在与人工胃液接触2h后全部死亡,而在1 h时,四株菌存活率的大小依次为ATCC19115>LM440>ATCC19111>ATCC15313。
进一步的将单增李斯菌ATCC19115和LM440分别接种到不同的模拟体系中观察毒力基因的表达,将ATCC19115接种到鱼肉基质模拟体系中,LM440接种到胃消化模拟体系中,培养后提取其总RNA,采用RT-qPCR对其四个毒力因子hlyA、inlB、ppfA、sigB的表达进行分析。结果表明,单增李斯特菌在鱼肉基质模拟体系中培养后,四个主要毒力因子在三文鱼基质上的表达量均高于平板对照,其中hlyA在贮藏4℃的三文鱼基质上表达上调的最为显著。
在不同的温度条件下贮藏24 h,inlB和hlyA的表达量均表现为7℃>4℃>0℃(P<0.01,P<0.01,P<0.01);且4个主要毒力因子在三文鱼基质上的相对表达量均表现为48h>24h(P<0.01)。在不同基质上培养后,进入人工胃液的单增李斯特菌LM 440的存活率与温度呈明显的正相关,培养温度越高,进入人工胃液后的存活率越大。进入人工胃液后的毒力因子hlyA、inlB、prfA、sigB的相对表达量与人工胃液(pH、胃蛋白酶)、培养基质、贮藏温度、贮藏时间均有一定的相关性。
参考文献
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