皮啡肽是一种具有强效镇痛活性的天然七肽，1981年首次从南美树蛙的皮肤中分离鉴定，是蛙类皮肤分泌物中具有强效生物活性的肽类成分之一。皮啡肽能够高选择性结合μ阿片受体（MOR），该受体是临床镇痛药物的主要作用靶点，与吗啡等经典阿片类药物作用机制相关。
固相合成[1]
1、树脂与原料准备氨基酸原料
依次准备Fmoc保护的氨基酸（Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-dAla-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH），其中酪氨酸（Tyr）和丝氨酸（Ser）的侧链羟基用叔丁基（tBu）保护，避免反应过程中副反应发生。
其他试剂：偶联剂（HOBt/TBTU）、碱（DIPEA）、脱保护剂（20%哌啶/NMP溶液）、切割试剂（TFA/H₂O/TIS混合液）等。
2、固相肽链组装
氨基酸偶联：将 Fmoc-AA-OH（4当量）、HOBt（4当量）、TBTU（3.8当量）与 DIPEA（8当量）溶解于DMF中，加入树脂悬浮液，室温下搅拌1小时，使氨基酸与树脂或已连接的肽链末端形成酰胺键。
Fmoc脱保护：偶联完成后，用20%哌啶/NMP溶液处理树脂（2次，每次10分钟），去除末端氨基酸的Fmoc保护基，为下一轮氨基酸偶联暴露氨基。
洗涤循环：每次偶联和脱保护后，用DMF（4次，每次2分钟）和CH₂Cl₂（3次，每次2分钟）交替洗涤树脂，去除未反应原料和副产物，避免交叉污染。
重复操作：按皮啡肽序列（Tyr→dAla→Phe→Gly→Tyr→Pro→Ser）依次重复 “偶联-脱保护-洗涤” 步骤，直至完整肽链组装完成，最终得到侧链保护的肽-树脂复合物（H-Tyr(tBu)-dAla-Phe-Gly-Tyr(tBu)-Pro-Ser(tBu)-Rink树脂）。
3、肽链切割与沉淀
切割试剂：配制TFA/H₂O/TIS混合液（体积比90:5:5），加入肽-树脂复合物中，室温下反应1.5小时，同时实现肽链从树脂上切割下来，并去除侧链保护基（tBu）。
过滤与沉淀：通过过滤去除树脂，收集含肽的TFA溶液；将该溶液缓慢加入冰浴冷却的乙醚/己烷混合液（体积比1:1）中，搅拌使皮啡肽肽链沉淀析出。
分离与干燥：通过离心收集沉淀，用乙醚洗涤2次，去除残留TFA和杂质，随后将沉淀溶于乙腈/水混合液（体积比1:1）中，冷冻干燥得到皮啡肽粗肽产物。
4、纯化与鉴定
纯化：采用反相制备型HPLC纯化，色谱柱为HIBAR Lichrospher 100 RP-18e（250×25mm），流动相为A相（H₂O/MeCN/TFA=95:5:0.1，v/v/v）和B相（H₂O/MeCN/TFA=5:95:0.1，v/v/v），线性梯度洗脱（5%B/min，初始保持5分钟A相），流速20mL/min，检测波长205nm（酰胺键）和254nm（芳香族基团）。
鉴定：通过分析型HPLC（保留时间t=14.5min）、质谱（ESI+，m/z=803.1，理论值[M+H]⁺=803.4）验证产物纯度和结构，最终获得纯度符合生物评价要求的皮啡肽纯品，总分离产率为47%。
参考文献
[1]Strack M, Bedini A, Yip K T, et al. A blocking group scan using a spherical organometallic complex identifies an unprecedented binding mode with potent activity in vitro and in vivo for the opioid peptide dermorphin[J]. Chemistry - A European Journal, 2016, 22(42): 14605-14610. https://doi.org/10.1002/chem.201602432.