柚苷酶(naringinase,EC 3.2.1.40) 是一类能将具有苦味柚皮苷水解为无苦味柚皮素的糖苷酶，利用该酶处理柑橘类产品，可在保持产品品质基础上去除苦味。该酶的脱苦机制源于其具有的α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶两种酶活性，首先,柚皮苷在α-L-鼠李糖苷酶活性下水解为鼠李糖和弱苦味的普鲁宁,然后,再在β-D-葡萄糖苷酶活性下将普鲁宁水解为葡萄糖和柚皮素。随着研究的深入,发现柚苷酶除能实现柑橘类产品脱苦外,在果酒增香、鼠李糖和普鲁宁制备、黄酮类转化及医药生产等方面也具有很大的应用价值。
目前国内外对柚苷酶的研究主要集中在两个方面：一是挖掘柚苷酶产生菌株并优化其发酵条件;二是获得高纯度柚苷酶。尽管柚苷酶的研究已取得一定进展,但相比其他酶的研究还存在众多不足,如产酶微生物种类相对单一、产酶水平不高、具有不同特性的酶种类缺乏、催化机制不明确及酶的克隆表达研究欠缺等,极大阻碍了柚苷酶的发展和应用。
来源
柚苷酶来源十分广泛,在植物、动物和微生物中均有发现。最早的柚苷酶是从芹菜籽中分离获得的,随后在柚子叶、达乌里鼠李、荞麦、海洋腹角蝾螺肝组织和猪组织中均分离得到柚苷酶。由于植物和动物来源的柚苷酶产量低,且受资源限制,生产成本高,目前用于工业化生产的柚苷酶源于微生物,主要包括霉菌、细菌和酵母等,其中霉菌是柚苷酶的主要生产菌株,包括曲霉属、青霉属、镰孢霉属、木霉属等,且曲霉属中的黑曲霉是生产柚苷酶的主要菌种。
目前,主要从自然环境中,如腐烂的柑橘类果皮或种植柑橘的果园土壤中筛选获得产柚苷酶菌株。在筛选方法上主要有透明圈法、高层试管法和定性滤纸显色法,其中透明圈法操作简单,结果直观,应用最为广泛[1]。
活力测定
根据柚苷酶所用底物及其水解产物不同,柚苷酶活力测定主要有分光光度法和高效液相色谱法(HPLC)两种。每种方法都有其各自的优缺点及适用条件,应结合实际情况合理选择柚苷酶酶活力测定方法。
1、分光光度法
该方法主要是依据柚苷酶测定所用底物及反应产物自身或与其他化合物发生化学反应产生能在特定波长处具有吸收能力的物质进行的。如柚苷酶底物柚皮苷在弱碱性环境与一缩二乙二醇发生化学反应产生黄色柚皮苷查尔酮,该产物在420 nm处具有特征吸收峰,可通过测定酶解后反应体系中柚皮苷残余量计算柚苷酶活力。该方法操作简单、快速,应用最为普遍,但误差大,准确度低。另外,柚皮苷分解终产物是葡萄糖,具有还原性,可依据其还原性测定柚苷酶活性,如 Ribeiro等利用碱性条件下3,5-二硝基水杨酸与酶活力测定体系中产生的葡萄糖反应产生棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸计算活力。此外,柚苷酶具有α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶活力,还可利用对硝基苯基-α-L-吡喃鼠李糖苷或对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷为底物进行酶活力测定,以释放出的浅黄色对硝基酚计算酶活力。总体而言,分光光度法操作简单,但却无法一次性知道复合酶中不同酶的活力,还会受到底物柚皮苷黄色本底的影响引起较大误差。
2、HPLC法
该方法具有高分辨率和高灵敏度,可同时测定柚苷酶反应体系中柚皮苷、柚皮素等成分,从而通过柚皮苷消耗量和柚皮素生成量准确计算出柚苷酶活性,并能获得其所包含的两种酶的活性,酶活测定精确度高,误差小。如Chen等通过HPLC法分别测定了体系中柚皮苷和普鲁宁含量，从而计算出鼠李糖苷酶、柚苷酶和葡萄糖苷酶活力。不难看出,HPLC法能直接反映柚苷酶及其发挥作用的两种酶活性大小,方法精确直观,不足之处在于操作复杂、费时[1]。
参考文献
[1] 宋金鹏,仲秀芳,胡晓晴,等. 微生物柚苷酶的研究进展[J]. 河南工业大学学报（自然科学版）,2024,45(2):19-30. DOI:10.16433/j.1673-2383.2024.02.003.