常规的反义寡核苷酸和小干扰核酸进入细胞较难，易被体内的核酸酶溶解，作用效果较差。然而，通过对常规的反义寡核苷酸和小干扰核酸进行化学修饰，可以提高稳定性、细胞穿透力及靶基因沉默活性等。其中，硫代修饰是最为有效的修饰之一，硫代反应的收率影响硫代反义寡核苷酸的产品纯度，硫代不完全会引入氧代的杂质。因此，要得到安全、有效的产品，硫代效率的高低至关重要，应该选择最优条件的硫代试剂来进行化学修饰。而与常用的硫代试剂（Beaucage，氢化黄元素）相比，新型硫代试剂DDTT（[（Dimethylamino-methy-lidene)amino]-3H-1，2，4-dithiazoline-3-thione）具有很好的稳定性和溶解性能，且硫代效率快，一般在2～3min内即可完成。
目前，DDTT的质量标准未见报道，且国家标准、中国药典也未收载其质量标准。含量的测定方法建立是质量研究的重要项目之一，作为新型、重要的核苷酸合成原料，本文对HPLC法测定DDTT的含量进行研究，建立其分析方法并经过验证。
检测方法[1]
1、供试品溶液的制备
取DDTT样品30mg，置于100mL容量瓶中，加入乙腈，超声使其溶解并稀释至刻度线后摇匀，配制供试品溶度为0.3mg/mL。
2、最大吸收波长的确定
取供试品溶液，经紫外分光光度计进行扫描（190～800nm），当吸收值为0.3～0.7时为最佳。
3、色谱条件的确定
色谱柱为Welch Xtimate色谱柱（4.6mm×150mm，5μm），流速为1mL/min，进样量10 μL，柱温为40℃，检测波长为270nm，流动相A为水，B为乙腈，梯度洗脱，方法如下表所示。
方法验证
1、系统适用性试验
流动相：A相为水，B相为乙腈，按上表进行梯度洗脱；二极管阵列检测器在190～400nm内检测；流速为1.0mL/min，柱温为40℃。 按照上述确定的色谱条件进1针溶剂作为空白对照，若空白谱图无异常，接着进1针浓度为0.3mg/mL的对照品溶液。理论塔板数为18 404，各杂质峰峰分离较佳，主峰与相邻杂质峰的分离度为12.86。
2、精密度
精密称取6份DDTT适量 ，并用乙腈配制成0.3mg/mL的供试液，将6份供试液分别连续进样，按色谱条件测定主峰面积的百分比，求得相对标准偏差RSD=0.02％。
3、强制降解实验
取供试品用适量乙腈使之溶解，加入酸破坏液（0.01mol/mL盐酸）1mL。用水浴锅80℃水浴10min，用乙腈稀释至0.3mg/mL后进样。 经过酸破坏后，新增加了两个杂质，且在主峰前原有的杂质峰位置杂质峰明显增强，均能够完全分离。
取供试品用适量乙腈使之溶解，加入氧化剂（1.5％双氧水）1mL。 用水浴锅80℃水浴10min，用乙腈稀释至0.3mg/mL后进样。经过双氧水破坏后，新增加了两个杂质，且在主峰前原有的杂质峰位置杂质峰明显增强，均能够完全分离。
以上结果证明，建立的分析方法专属性强，本品DDTT在贮存等条件下若产生新的杂质，能够有效地加以控制，从而保证最终产品的质量安全性。
4、检测限和定量限
取0.3mg/mL的DDTT供试品溶液，逐级稀释至浓度分别为0.0015mg/mL、0.00225mg/mL、0.003mg/mL、0.00375mg/mL、0.0045mg/mL，按照色谱条件分别进1针空白以证明系统无异常。然后，将上述5个浓度的溶液按照浓度由低至高的顺序进样，每个浓度分别进样3针，测定每个浓度的信噪比，并求得每个浓度的信噪比的平均值。检测限定为信噪比为3的浓度值，定量限定为信噪比 为10的浓度值，根据5个浓度的检测结果，配制0.0009mg/mL供试液进样3针，可以得到信噪比。
5、线性
线性测定范围选为供试液浓度的50%～150%，即0.15～0.45mg/mL，精密称取DDTT适量并用乙腈配制成2.5mg/mL作为母液，分别稀释至0.15mg/mL、0.225mg/mL、0.3mg/mL、0.375mg/mL、0.45mg/mL，按照色谱条件分别进1针空白以证明系统无异常。然后，将上述5个浓度的溶液按照浓度由低至高的顺序进样，每个浓度分别进样3针，测定每个浓度主峰的面积，并求得每个浓度主峰面积的平均值，按照浓度由低至高的顺序，5个浓度下主峰面积的相对标准偏差RSD分别为0.29%、0.22%、0.17%、0.08%、0.50%。以浓度为自变量、相应浓度主峰面积的平均值为因变量，求得线性回归方程为y=28755x-334.49，线性相关系 数R=0.9993（R2 =0.9987），如图所示[1]。
参考文献
[1] 张春芳,梁毅,沈启雯. HPLC测定新型硫代试剂[（二甲基氨基-亚甲基）氨基]-3H-1，2，4-二噻唑-3-硫酮纯度方法及其验证[J]. 机电信息,2016(20):50-54,58. DOI:10.3969/j.issn.1671-0797.2016.20.010.