介绍
环孢霉素D是一类由真菌产生的环状十一肽，自1976年瑞士山德士公司首次报道多孔木霉产生的环孢霉素以来，其在医学领域的应用价值便备受瞩目。其中，环孢霉素A作为经典的免疫抑制剂，显著提升了心、肾、肝、胰等器官移植的成功率，但其较强的肝肾毒性限制了临床应用。
图一 环孢霉素D
来源
环孢霉素D主要来源于真菌代谢产物，本研究中使用的菌株为从山核桃根际土壤中分离得到的炭团菌属真菌HypoxylonSpp.sj18，该菌株经形态学和分子生物学（ITSrDNA序列）鉴定确认，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，GenBank登录号为MH374077。研究人员通过40L大麦成熟胚培养基发酵培养7天，经丙酮提取、减压浓缩后得到粗提物，每40L发酵液仅能获得1.2g粗样品，可见环孢霉素D在微生物代谢产物中含量极低。
分离问题
微生物代谢产物具有成分复杂、目标物含量低、杂质与目标物性质相似等特点，传统的分离纯化方法如柱层析、重结晶等，不仅操作繁琐、耗时耗力，还存在固体载体吸附导致的目标物损失和生物活性降低等问题。逆流色谱（CCC）作为一种无固体载体的液-液分配色谱技术，利用溶质在两种互不相溶溶剂中的分配系数差异实现分离，避免了固-液吸附脱附过程对分子构象和活性的影响，特别适合生物活性分子的制备分离。然而，传统逆流色谱的分离效率受色谱柱长度限制，对于分配系数不理想的组分，往往难以实现环孢霉素D有效分离。
分离纯化技术的优化
理想的分配系数（Kd）应在0.5~2之间，且越接近1分离效果越好。首先筛选了常用于分离环孢霉素类化合物的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（HEMW）系统，测定了不同体积比下环孢霉素D的分配系数：当体积比为2:1:2:1时，Kd=1.62；3:1:3:1时，Kd=0.78；2.5:1:2.5:1时，Kd=1.09，处于理想范围。采用该溶剂系统进行传统逆流色谱分离时，虽然分配系数理想，但实际分离效果不佳。实验发现，粗提物样品在含水溶剂系统中出现一定程度的浑浊，导致固定相不断流失，最终分离得到的环孢霉素D含量极低。
为解决传统逆流色谱的分离效率问题，开发了改进型闭环循环逆流色谱（CLRCCC）技术。该技术通过在进样口与检测器出口之间加装六通切换阀，使色谱柱流出液能够直接重新注入同一色谱系统进行多次循环分离，从而在有限的仪器柱长条件下模拟无限延长的色谱柱，显著提升分离度。尝试了正己烷-乙腈（1:1，v/v）溶剂系统，虽然环孢霉素D在该系统中的分配系数仅为0.05，远低于传统逆流色谱的理想范围，但通过闭环循环技术，能够实现目标物与杂质的有效分离。实验优化的分离条件为：以上相为固定相，下相为流动相，流速6.0mL/min，转速1100rpm，分离温度25℃，固定相保留率达65.6%。
分离结果
在优化的闭环循环逆流色谱条件下，从300mg粗提物样品中成功分离得到28mg环孢霉素D，经高效液相色谱（HPLC）检测，纯度达95.2%。两次分离实验共从680mg粗提物中获得64mg环孢霉素D，分离效率显著高于传统逆流色谱。分离得到的化合物通过¹HNMR、¹³CNMR和电喷雾电离质谱（ESI-MS）进行结构鉴定。ESI-MS数据显示其准分子离子峰为m/z1216.8712[M+H]⁺，推导其分子式为C₆₃H₁₁₃N₁₁O₁₂。¹³CNMR数据与文献报道的环孢霉素D数据高度一致，各氨基酸残基的碳信号位移偏差均在合理范围内，确认分离得到的化合物为环孢霉素D[1]。
图二 HPLC图
参考文献
[1]LI H P, ZHANG F Y, JIN Q Y, et al. Preparative separation and purification of Cyclosporin D from fungus Hypoxylon Spp. by improved closed-loop recycling counter-current chromatography[J]. Journal of Chromatography A, 2021, 1649: 462221. DOI:10.1016/j.chroma.2021.462221.