恶性肿瘤是严重危害人类健康的常见疾病之一，并呈逐年上升的趋势。侵袭和转移是恶性肿瘤的两个最主要的生物学特征和标志，也是肿瘤患者治疗失败和死亡的根本原因。目前，传统细胞毒性药物仍将是抗肿瘤转移与复发的主体，细胞毒性药物抗肿瘤疗效显著，但是它杀伤肿瘤细胞的同时也杀伤了正常细胞，因此，研发新的低毒高效抗肿瘤靶向药物是转化医学的一个重要前沿。4-甲基-3-硝基苯甲酸是从以五种分子结构为母体的小分子化合物库中筛选得到的，初步体外实验证实其能够明显抑制肿瘤细胞的运动。
实验方法[1]
1、细胞培养
上述细胞用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基(不含抗生素),在37℃,5%CO2和饱和湿度的培养箱中培养,0.25%胰酶消化传代。
2、急性毒性实验
实验采用昆明种小鼠,体重18~22g,雌雄各半。在药物溶解达饱和度时达最大浓度,经腹腔注射4-甲基-3-硝基苯甲酸溶液,找出引起小鼠100%和0死亡的剂量,探索得到的剂量范围为:在621.5mg/kg和932.7mg/kg之间,由于药物达到所能配制的最大浓度为26.65mg/mL,给药体积设定为0.35mL/10g。将80只昆明种小鼠随机分为8组，每组10只,雌雄各半。4-甲基-3-硝基苯甲酸在各组剂量按等比数列排列,将各组药物配成一定浓度，对其体内毒性进行检测。
3、趋化实验
首先将不同的肿瘤细胞分别接种到35mm的培养皿中,使其贴壁生长。各加入不同浓度的4-甲基-3-硝基苯甲酸作用24h后,消化、计数调整细胞数为0.5x105个/mL。在趋化小室下室加入30uL孔终浓度为10ng/mL的EGF,未加EGF作对照;取孔径为10um的聚碳酸酯膜0.001% Fibronectin包被后置于趋化小室的上下室之间,在上室分别加入上述细胞悬液,50uL孔。将趋化小室放在37℃,5%CO2饱和湿度的培养箱中培养3h。然后取碳酸酯膜,刮洗掉没有穿过膜的细胞,将膜固定染色后,在倒置显微镜下随机取3个视野(40x),并计数穿过膜的细胞数,趋化指数=EGF刺激后穿膜细胞数/无EGF刺激穿膜细胞数。
4、动物实验
无菌条件下,取2只生长旺盛、无破溃的BL6-B16荷瘤小鼠,颈椎脱臼处死,在无菌条件下剥离肿瘤,用剪刀将肿瘤剪成小碎块,放入无菌的玻璃匀浆器,生理盐水按体积1:10稀释研磨后,用80目滤网过滤。将混匀的肿瘤细胞悬液接种于4~6周龄,雌性,C57小鼠右前肢腋部皮下,每只小鼠接种细胞1x107个。18只小鼠随机分成4-甲基-3-硝基苯甲酸组(200mg/kg)和对照组(0mg/kg),毎组9只,每日1次灌胃给药,用游标卡尺测量肿瘤长短径,计算肿瘤体积。给药14天后结束实验,留取瘤块,依据瘤块重量和测量体积评价药物疗效。数据用x±s表示;肿瘤生长抑制率(瘤重)=(对照组瘤重-给药组瘤重)/对照组瘤重x100%;肿瘤生长抑制率(瘤体积)=(对照组瘤体积-给药组瘤体积)对照组瘤体积x100%;肿瘤体积计算方法,肿瘤体积V:V=1/2xaxb2(a为肿瘤的长径,b为肿瘤的短径)。同时,对其体重进行监测,观察药物毒性反应。
实验结果
1、急性毒性实验
小鼠体内急性毒性实验结果显示,4-甲基-3-硝基苯甲酸的半数致死量LD50为771.73mg/kg。半数致死量LD50的95%置信区间为729.73~816.15mg/kg。4-甲基-3-硝基苯甲酸在体内是低毒性的,具有生物安全性。
2、趋化实验
在肺癌细胞A549、肝癌细胞SSMC-7721、恶性黑色素瘤细胞LiBr、胃癌细胞MGC-803在EGF 10ng/mL作用下,趋化3h后,计数4-甲基-3-硝基苯甲酸处理24h后,经EGF刺激因子趋化穿透膜的细胞数,计算趋化指数作图后,结果显示,4-甲基-3-硝基苯甲酸可以抑制上述细胞在EGF诱导下的趋化运动能力,抑制作用随药物浓度增加而增强,如图所示,4-甲基-3-硝基苯甲酸的最适作用浓度在2.0uM。
3、动物实验
4-甲基-3-硝基苯甲酸可以抑制BL6-B16小鼠黑色素移植瘤生长。4-甲基-3-硝基苯甲酸给药组对BL6-B16小鼠黑色素移植瘤生长产生明显的抑制作用,肿瘤体积(P<0.05)和重量(P<0.01)显著低于对照组。4-甲基-3-硝基苯甲酸给药组小鼠均未见急性毒性反应;动物活动正常,与对照组相比,体重增长一致,实验期间各实验组动物均未死亡。
参考文献
[1] 李萌辉,张飞,郭华,等. 细胞运动抑制剂4-甲基-3-硝基-苯甲酸的基础研究[J]. 中国肿瘤临床,2010,37(11):601-604. DOI:10.3969/j.issn.1000-8179.2010.11.001.