概述
隐绿原酸是存在于桑叶中的一种酚酸类化合物，其分子式为C16H18O9，相对分子质量为354.31。先前的文献报道，隐绿原酸具有促进成骨细胞分化和抗糖尿病等药理作用。隐绿原酸通过诱导MC3T3E1和C3H10T1/2细胞成骨基因mRNA水平的表达，通过表达远端无同源框5(Dlx5)、DNA结合蛋白抑制剂(Id1)和runt相关转录因子2(Runx2)等成骨基因，促进在早期的成骨细胞分化。此外，隐绿原酸可以浓度依赖性的方式显著改善糖尿病模型中血糖水平、铁含量、脂质过氧化物的积累，并且通过激活胱氨酸/谷氨酸转运蛋白系统(XC)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)/Nrf2和抑制核受体共激活因子4(NCOA4)来抑制细胞的铁死亡，从而起到抗糖尿病作用。天然酚酸类成分具有较好的抗氧化，抗菌，抗病毒和解热特性。可以在预防炎症性疾病中发挥重要作用。已有文献报道，绿原酸，新绿原酸和隐绿原酸是桑叶中重要的咖啡酰奎宁酸化合物。4-咖啡酰奎宁酸(4-CQA)，也称为隐绿原酸(CGA)，是绿原酸的异构体。
提取方法[1]
1、标准溶液的配制
精确称量隐绿原酸(CGA)10 mg，用甲醇(色谱级)溶解转移至10mL容量瓶中，定容后摇匀，配置成(1.0mg/mL)的标准母液。经0.45μm微孔滤膜过滤，然后用封口膜密封保存在4℃条件下，备用。
2、样品溶液的制备
桑叶购自哈尔滨药材市场。将桑叶自然阴干，待干燥后，用粉碎机粉碎，过60目筛，备用。参照文献提取桑叶方法并稍作调整，取 250mL锥形瓶，加入5.0g桑叶粉末和100mL浓度为75%的乙醇溶液，将混合溶液置于功率200W的超声清洗机中于室温下进行提取，提取时间为1h。在提取过程中，超声水浴中水位始终保持高于圆底烧瓶中萃取溶剂的水位，同时用封口膜包裹圆底烧瓶口以防止溶剂损失，提取结束后得样品粗提液。
于旋转蒸发仪上浓缩至无溶剂，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇按照体积比(1:1)进行萃取，萃取反复重复三次使萃取完全，并浓缩至干。分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水溶物。并用一定体积的色谱甲醇溶解，经0.45μm微孔滤膜过滤后，封存备用。
3、桑叶中隐绿原酸的HPLC分析
采用Agilent 1200系列高效液相色谱法对桑叶中的酚类物质进行分析和检测。参照文献并稍作调整。检测桑叶中隐绿原酸方法，色谱柱采用Diamonsil C18反相柱(250mm×4.6mm,5μm,Dikma)，进样量5μL，柱温30℃，流速0.9mL/min，流动相为0.1%磷酸 (A)-乙腈(B)水溶液，梯度洗脱程序为：0-20min，10-13%B；20-27min，13-18%B。
4、提取率
目标成分的提取率按照以下公式计算。
含量(mg/g)=(C×V)/M
C：样品溶液中目标化合物浓度(mg/mL)
V：样品溶液体积(mL)
M：桑叶粉末干重(g)
5、桑叶中隐绿原酸的分离
采用高速逆流色谱法，溶剂体系为乙酸乙酯:水=1:1；洗脱流速：2.0mL/min；主机转速：900rpm；上样量：200mg；分离温度；25℃；检测波长：325nm；进行HSCCC分离，在此条件下分离出隐绿原酸，之后通过HPLC和ESI-MS的方法对其化合物的纯度和化学结构进行测定。
活性研究
探讨隐绿原酸(CCGA)调节牙龈卟啉单胞菌刺激下巨噬细胞胆固醇吸收的作用及机制,为CCGA治疗动脉粥样硬化临床应用提供基础。方法通过牙龈卟啉单胞菌来源的脂多糖(Pg.LPS)加干扰素(IFN-γ)刺激小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW 264.7)系建立模型,利用CCGA处理细胞后,检测其转录组水平变化差异,筛选并确定差异基因;采用实时聚合酶链式反应(q-PCR)和免疫印迹(WB)方法验证基因和蛋白表达;最后利用胆固醇检测实验验证隐绿原酸通过该途径抑制巨噬细胞的胆固醇吸收。结果通过转录组测序技术(RNA-seq)分析结果,发现Pg.LPS刺激后CD36表达上调,而隐绿原酸处理后抑制了CD36的表达,并且通过q-PCR和WB验证隐绿原酸能够抑制CD36的转录的蛋白水平的表达。检测80mg·L-1氧化修饰型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导巨噬细胞泡沫化后细胞内胆固醇含量,验证隐绿原酸能抑制巨噬细胞胆固醇的吸收。因此，隐绿原酸能通过下调CD36的表达,抑制牙龈卟啉单胞菌刺激下巨噬细胞胆固醇的吸收[2]。
为探讨隐绿原酸(4-CQA)对感染H9N2亚型禽流感(H9N2-AIV)病毒的小鼠造成肺损伤的修复作用,将90只6～8周龄健康昆明系小鼠随机分为病毒(H9N2)感染组、H9N2+4-CQA组、空白对照组、隐绿原酸对照组,用H9N2-AIV滴鼻复制小鼠肺损伤模型并灌胃隐绿原酸干预。观察各组小鼠肺组织病理学变化;测定肺指数及肺内丙二醛(MDA)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、髓过氧化物酶(MPO)含量;测定脾内T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+百分比及比率(CD4+/CD8+).结果显示,H9N2组小鼠表现出精神沉郁、呼吸急促;肺指数上升、脾指数下降;肺组织病理学表现为肺泡萎缩、肺泡隔增厚、局部肺实变;T淋巴细胞亚群CD4+/CD8+比率显著下降(P<0.05);肺内T-SOD活性显著下降、MDA含量显著增加、MPO活性显著升高(P<0.05)。4-CQA干预后,小鼠肺指数下降、脾指数上升;肺组织病理学损伤减轻;T淋巴细胞亚群CD4+/CD8+比率显著上升(P<0.05);肺内T-SOD活性显著升高,MDA含量显著降低,MPO活性显著下降(P<0.05)。得出4隐绿原酸可通过维持机体免疫平衡、降低机体氧化损伤来缓解由H9N2亚型AIV诱导的小鼠肺损伤[3]。
参考文献
[1] 赵雪莲. 桑叶中隐绿原酸的抗炎活性及初步机制研究[D]. 黑龙江:东北林业大学,2021.
[2] 张宇昊,张文杰,张非凡,等. 隐绿原酸可以抑制巨噬细胞胆固醇吸收功能及机制的研究[J]. 江西医药,2024,59(12):1095-1098. DOI:10.3969/j.issn.1006-2238.2024.12.001.
[3] 张昕,张铭,何宏轩,等. 隐绿原酸对H9N2-AIV致小鼠肺损伤的免疫调节和抗氧化效果[J]. 浙江农业学报,2022,34(1):33-40. DOI:10.3969/j.issn.1004-1524.2022.01.05.