介绍
3,4-二氯苯甲酸（3,4-dichlorobenzoicacid,3,4-dCBA）属于二取代芳香污染物，主要通过除草剂、多氯联苯等广泛分布的人工化学品在环境中经微生物分解间接释放。由于氯原子的取代效应会提升芳香环的稳定性，该化合物在自然环境中降解缓慢，且具有一定生态毒性。
图一 3,4-二氯苯甲酸
微生物降解
仅发现不动杆菌可在4-CBA存在时共代谢3,4-dCBA，而能以3,4-dCBA为唯一碳源和能源生长的菌株，仅有Alcaligenessp.BR60与Alcaligenessp.CPE3两株。这两株菌可能是通过苯甲酸3,4-双加氧酶途径降解3,4-dCBA，且该途径不会生成有毒的氯代邻苯二酚中间产物，但始终缺乏酶学层面的直接实验验证。CPE3菌株虽已被证实可完全脱氯降解3-CBA、4-CBA与3,4-dCBA。
CPE3菌株粗酶液的代谢活性
以3,4-dCBA为唯一碳源培养CPE3菌株，制备无细胞粗提液，在体外重构降解反应体系，三种底物的代谢均严格依赖氧气，严格厌氧条件下无任何降解活性，证实其为典型的好氧氧化过程。在辅酶依赖模式上，三种底物呈现出显著的差异性：3-CBA与4-CBA的降解仅以氧气与NADH为必需辅酶，外源添加Fe²+、FAD、FMN可进一步提升降解活性，但并非反应必需；而3,4-dCBA的降解除氧气与NADH外，必须同时添加FAD与FMN才能启动反应，且降解活性随FAD、FMN浓度升高显著增强，Fe²+的促进作用则相对微弱。这种对黄素辅酶的强制性需求，证明3,4-dCBA的降解酶系与单氯苯甲酸存在组分差异。此外，实验确定三种底物的降解最适pH均为7.15左右，最适反应温度为30℃；同时降解比活性与蛋白浓度呈非线性关系，符合多组分酶系统的典型动力学特征，参与反应的是由氧化还原酶、电子传递链等组成的复合酶系。
降解动力学特征
3,4-二氯苯甲酸的降解动力学比较特殊，比活性随底物浓度升高呈现双峰分布，分别在0.08mM与0.40mM左右出现两个活性峰值。CPE3菌株中存在两套功能重叠但底物亲和力不同的酶系统，共同参与3,4-dCBA的降解：低浓度下由高亲和力酶系主导反应，高浓度下则启动另一套低亲和力、高容量的酶系。粗酶液的动力学规律与此前完整细胞的生长动力学高度一致，说明CPE3对氯代苯甲酸的降解限速步骤为胞内酶促反应，而非底物跨膜运输，这与单氯代苯甲酸可通过被动扩散进入细菌细胞的说法相吻合。
图二 CPE3粗提物的特异性活性随着3,4-二氯苯甲酸浓度的变化
降解途径
粗酶液无法代谢邻苯二酚、4-氯邻苯二酚、3,4-二氯邻苯二酚、4,5-二氯邻苯二酚及4-羟基苯甲酸，也未检测到邻苯二酚1,2-双加氧酶活性与水解脱氯活性；但可高效代谢3-氯-4-羟基苯甲酸与3,4-二羟基苯甲酸，后者代谢时生成黄色特征产物。CPE3通过苯甲酸3,4-双加氧酶途径降解氯代苯甲酸。该途径直接在苯甲酸母核的3、4位发生双羟基化并同步脱氯，生成3,4-二羟基苯甲酸后进入中心代谢，而非传统的先脱羧生成氯代邻苯二酚再开环的路径[1]。
参考文献
[1] Fava F., Marchetti L., Baldoni F.. METABOLISM OF META- OR/AND PARA-CHLORINATED BENZOIC ACIDS BY THE CRUDE EXTRACT OF ALCALIGENES SP STRAIN CPE3 GROWN ON 3,4-DICHLOROBENZOIC ACID[J]. Biotechnology Letters,1996,18(9):1007-1012.