多重荧光染色-标准实验流程

TSA信号放大原理：

利用二抗上带有的HRP（而不是直接偶联荧光素），来催化后续添加入体系的非活性荧光素。荧光素在HRP和过氧化氢的作用下被活化，跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合；然后微波清洗，前一轮非共价结合的抗体被洗掉，共价结合的荧光素还留存在样品上。再换个一抗来第二轮孵育，周而复始。等到所有抗体孵育结束，荧光素都结合好后，最后去检测结果。

mIHC试剂盒组分：TSA染料、信号放大液、多聚HRP二抗、抗荧光淬灭封片剂、DAPI

检验方法：

1.所需仪器设备：移液器、恒温干燥箱、微波炉、免疫组化笔（abs929）、修复杯、染色缸、计时器、孵育湿盒、盖玻片、通风橱、洗瓶、荧光显微镜、量筒100ml、量筒1000ml等。

2.所需试剂：灭菌去离子水（abs9259）、二甲苯、乙醇（100%、95%、70%）、4%多聚甲醛（abs9179）、抗原修复液（abs9342/abs9248）、内源性蛋白封闭液（abs933）、内源过氧化物酶淬灭（abs9333）、TBST（abs952）、PBST（abs9340）等。

3.试剂准备：

1）荧光染料的稀释：染料为100×母液，使用信号放大反应液按1:100稀释制备染料工作液（现用现配）；DAPI使用无菌水按1:100稀释制备工作液。

2）二抗的使用：兔鼠通用的二抗，适用于兔和小鼠的一抗，样本是除鼠兔之外的样本，

兔的二抗，适用于兔的一抗，样本是除兔以外的样本。

4.检测设备：荧光显微镜或荧光全片扫描设备，TSA单色荧光染料适用的激发和发射滤光片应符合表中的建议。

【石蜡切片操作步骤】

1.脱蜡水合

a）新鲜二甲苯浸片10min，重复3次；

b）梯度乙醇浸片：100% 5min；95% 5min；70% 2min；

c）灭菌水洗片1min，重复3次；

d）10%中性福尔马林或4%多聚甲醛（abs9179）浸片10-30min，灭菌水洗片1min，重复3次；（可选项，视样本质量而定）

e）滴加破膜剂（abs9149）通透15min，PBST（abs9340）浸洗3min，重复3次。（可选项，一般情况下可不做）

2.微波修复抗原

a）将脱蜡水合后的玻片置于修复杯中，用抗原修复液1×工作液浸没；

b）将修复杯置于微波炉内高火煮沸；

c）低火维持15min（注意补液，防止蒸发过度导致干片）；

d）取出室温自然冷却至室温。

3.淬灭和封闭

a）去除玻片上残存洗液；

b）用组化笔（abs929）圈出玻片上的样本区域，滴加3%过氧化氢（abs9333）覆盖样本区域，孵育10min，PBST浸洗3min，重复3次；

c）去除玻片上残存洗液，滴加封闭液（abs933），覆盖样本区域，室温保湿震荡10-30min，除去封闭液。

4.一抗孵育

a）去除玻片上的封闭液。

b）用移液器滴加稀释的一抗溶液，浸没样本区域。

c）室温保湿震荡孵育1h（需针对不同抗体做优化调整）。

d）用1×TBST buffer浸洗玻片3min，重复1次。

5.二抗孵育

a）去除玻片上残存的洗液；

b）直接滴加HRP二抗工作液溶液，浸没样本区域；

c）室温保湿孵育10min；

d）用1×TBST（abs952） buffer浸洗玻片3min，重复1次。

6.荧光染色放大信号

a）去除玻片上残存的洗液。

b）用移液器在玻片上滴加1×染料工作液100ul（使用信号放大液按1:100稀释）浸没样本区域。

c）室温保湿震荡孵育10min。

d）1×TBST buffer浸洗玻片，室温浸片3min。重复3次。

e）微波修复，室温自然冷却至室温或者用抗体洗脱液（abs994）洗掉未结合上的一二抗和染料。

f）灭菌水洗片1次，1×TBST buffer浸片2min。

7.新一轮染色（单染可直接进行第8步）

a）每轮染色结束后可用荧光显微镜确认染色情况，注意用TBST覆盖样品，防止干片。

b）封闭：去除玻片上残存洗液，滴加封闭液，覆盖样本区域，室温保湿震荡10-30min，除去封闭液。（无需淬灭步骤）

c）重复步骤4-6

d）多轮染色重复步骤7，a）— c）结束后进行染核及封片

8.染核及封片

滴加1×DAPI工作液到样品上，浸没样本区域，室温孵育5min。用1×TBST浸洗玻片3次，每次2min。然后滴加抗荧光淬灭封片剂（abs9853），用盖玻片封片，避免气泡，长期保存请用透明指甲油对盖玻片边缘进行密封。

9.阅片

对染色后的组织片在荧光显微镜下观察并分析。

【冰冻切片操作步骤】

需搭配抗体洗脱液（abs994）

1.淬灭、通透、封闭

a）从冰箱中取出冷冻玻片，恢复至室温，PBST（abs9340）浸洗3min，重复3次；

b）10%中性福尔马林或4%多聚甲醛（abs9179）浸片10-30min，灭菌水洗片1min，重复3次；（可选项，视样本质量而定）

c）滴加破膜剂（abs9149）通透15min，PBST浸洗3min，重复3次；（可选项，一般情况下可不做）

d）用组化笔（abs929）圈出玻片上的样本区域，滴加3%过氧化氢（abs9333）覆盖样本区域，孵育10min，PBST浸洗3min，重复3次；

e）去除玻片上残存洗液，滴加封闭液（abs933），覆盖样本区域，室温保湿震荡10-30min，除去封闭液。

 2.一抗孵育

a）去除玻片上的封闭；

b）用移液器滴加稀释的一抗溶液，浸没样本区域；

c）室温保湿震荡孵育1h（需针对不同抗体做优化调整）；

d）用1×TBST buffer浸洗玻片3min，重复1次。

3.二抗孵育

a）去除玻片上残存的洗液；

b）直接滴加HRP二抗工作液溶液，浸没样本区域；

c）室温保湿孵育10min；

d）用1×TBST buffer浸洗玻片3min，重复1次。

4.荧光染色放大信号

a）去除玻片上残存的洗液。

b）用移液器在玻片上滴加1×染料工作液100ul（使用信号放大液按1:100稀释）浸没样本区域。

c）室温保湿震荡孵育10min。

d）1×TBST（abs952） buffer浸洗玻片，室温浸片3min。重复3次。

e）滴加抗体洗脱液（abs994），37℃孵育15-20min。

f）灭菌水洗片1次，1×TBST buffer浸片2min。

5.新一轮染色（单染可直接进行第6步）

a）每轮染色结束后可用荧光显微镜确认染色情况，注意用TBST覆盖样品，防止干片；

b）封闭：去除玻片上残存洗液，滴加封闭液，覆盖样本区域，室温保湿震荡10-30min，除去封闭液；

c）重复步骤2-4；

d）多轮染色重复步骤5，结束后进行染核及封片。

6.染核及封片

滴加1×DAPI工作液到样品上，浸没样本区域，室温孵育5min。用1×TBST浸洗玻片3次，每次2min。然后滴加抗荧光淬灭封片剂（abs9853），用盖玻片封片，避免气泡，长期保存请用透明指甲油对盖玻片边缘进行密封。

7.阅片

对染色后的组织片在荧光显微镜下观察并分析。

【细胞样本建议操作步骤】 

1.样本准备：制备细胞样本（细胞爬片（abs7029）、细胞涂片等），建议直接使用腔室载玻片进行细胞培养，方便后续检测。完成制备后，用PBS简单漂洗（2×2min）；

2.细胞固定：用4%多聚甲醛（abs9179）常温固定10-20min，PBS洗涤3×5min；

3.淬灭内源性过氧化物酶：滴加3% H2O2（abs9333），室温下孵育10-30min，PBS洗涤3×5min；

4.细胞通透（胞膜指标省略此步）：滴加含1-0.25% Triton X-100(abs9149)的PBS溶液，室温下处理10min，PBS洗涤3×5min；

5.封闭：滴加封闭液（5%二抗同来源封闭血清（abs933）或BSA），室温孵育30min；

6.一抗孵育：弃封闭液，滴加稀释好的一抗工作液，于避光湿盒内4°C孵育过夜或37℃ 1-2h（湿盒中可加少量水，防止抗体孵育过程干片），PBS漂洗3×5min；

7.二抗孵育：滴加与一抗相应种属的HRP二抗覆盖组织，避光室温孵育20-50min，PBS漂洗3×5min；

8.染料孵育：滴加现配的1*TSA染料工作液（使用信号放大液按1:100稀释），反应1-10min，PBS漂洗3×5min；

9.抗体洗脱：抗体洗脱液（abs994）37℃预热，甩去PBS后，滴加洗脱液浸润整个爬片，洗脱时间可控制在15-30min（洗脱难度：结构性膜蛋白和细胞骨架蛋白＞胞浆蛋白＞胞核蛋白），PBS漂洗3×5min；

10.重复进行步骤[5→9]，直到完成所有指标染色；

11.滴加1*DAPI工作液到样品上，浸没样本区域，室温孵育10min，PBS漂洗3×5min；

12.封片：滴加抗荧光淬灭封片剂（abs9853），用盖玻片封片，避免气泡。

13.扫描成像，数据分析。

【类器官样本建议操作步骤】 

1、样本准备：

类器官收集 

收集生长至较大尺寸类器官：96孔板，生长密度较大时，使用移液枪取半孔以上，清洗1至3遍，洗去大部分基质胶，离心沉淀，弃除大部分上清。2、琼脂糖固定槽制备（可一次制备一批，温密闭保存）

1）称量0.2至0.4g琼脂糖，加入至烧杯或者小试剂瓶内；

2）加入10mL左右PBS；

3）微波炉高火融化，每隔5s暂停打开，观察，重复数次至琼脂糖融化完全；

4）取约200uL融化琼脂糖，加入至600uL EP管内；

5）在盛有琼脂糖的小EP管内插入一小PCR管，使琼脂糖形成一圆尖底凹槽，室温或者4℃冰箱静置数分钟，至琼脂糖凝固，轻轻转动小PCR管，取出PCR管，可看到琼脂糖内形成一个深圆尖底槽。

类器官固定

1）将类器官轻轻吸出转移至一固定槽底部；

2）轻轻加入PBS至高于琼脂糖槽的边缘；

3）盖上盖子，水平离心机1000rpm，离心5min；

4）轻轻吸出除底部类器官沉淀外的PBS上清；

5）加入融化的琼脂糖液体200μL；

6）室温静置至琼脂糖完全凝固；

7）剪去固定管的底部和盖子，置于2 mL EP管内，加入多聚甲醛至差不多装满整个EP管，置于4℃冰箱过夜。

类器官包埋 

1）脱水：取出已凝固的含有类器官沉淀的琼脂糖块，在梯度乙醇中脱水，70%、80%、90%、95%乙醇各1h，100%乙醇30min, 待其凝固。

2）融蜡：提前4h左右打开烘箱，65℃溶蜡。

3）透明：将脱水完成后的琼脂糖块转移至组织包埋盒中（二甲苯处理前需一直浸泡在无水乙醇中），将包埋盒转移至二甲苯中5min处理两次。

注：因二甲苯有毒性，需在通风良好区域进行操作，取出时尽量沥尽残留二甲苯。

4）浸蜡：透明化处理完成后立即转入已经融化的蜡缸中，60℃浸蜡2h后，更换新的蜡缸再次浸蜡2h。

5）包埋：包埋在冰盒上进行，将融好的纯蜡倒入蜡盒三分之一处，将琼脂块放置于中间位置，然后再滴蜡包埋直到倒满。待蜡块完全凝固后，小心脱下模具。

2、烤片：60℃烤片30min。

3、脱蜡、水化：二甲苯（5min）——二甲苯（5min）——二甲苯（5min）——100%乙醇（5min）——100%乙醇（5min）— —95%乙醇（3min）——85%乙醇（3min）——75%乙醇（3min）——去离子水（5min)。

4、抗原修复：取200ml抗原修复液，加入染色盒中，将组织切片置于染色盒内耐高温塑料切片架上，置于高压锅内加热至饱压，然后继续加热5min，关闭电源，10min后取出染色盒，室温冷却30min，画上阻水圈，置入PBST浸洗3次，每次3min。

5、阻断内源性过氧化物酶：每切片加100μL3% H2O2（abs9333），室温下孵育10min，PBST浸洗3min×3次。

6、封闭：除去PBST液，每张切片加100μL 5%山羊血清封闭液（abs933），室温孵育30min，除去封闭液。

7、一抗孵育：每张切片加100μL一抗工作液，室温保湿孵育1h，PBST浸洗3min×3次。

8、二抗孵育：除去PBST，每张切片加100μL二抗，室温保湿孵育15min，PBST浸洗3次，每次3min。

9、染料孵育：除去PBST，每张切片加100μL现配的1*染料工作液（使用信号放大液按1:100稀释），孵育10min后，置入 PBST内洗涤，室温浸片洗涤3次，每次3min。

10、抗体洗脱：抗体洗脱液（abs994）37℃ 预热，滴加少量抗体洗脱液覆盖样本，室温放置3~5min；弃去洗脱液，再次滴加足量的洗脱液覆盖样本，37°C 孵育20min；PBST浸洗3次，每次3min。

11、重复步骤（6）-（10），直至所有目标抗体染色完成。

12、核染：滴加1*DAPI工作液到样品上，浸没样本区域，室温孵育10min后，用1*PBST浸洗玻片3次，每次2min。

13、封片：滴加抗荧光淬灭封片剂，用盖玻片封片，避免气泡。

14、扫描成像，数据分析。

附：

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