ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种依赖抗原-抗体特异性结合与酶促显色反应的定量检测技术。其结果的准确性高度依赖于每一步试剂的配比与反应条件。不恰当的配比会导致信号弱、背景高、非特异性结合等问题，直接影响数据可靠性。因此，在正式实验前进行系统性优化至关重要。
主要优化方向与方法
一、包被缓冲液优化
缓冲液选择：优先使用pH 9.6的碳酸盐缓冲液（50mM），其疏水表面更利于蛋白质吸附。若抗原对pH敏感，可尝试pH 7.6的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
抗原浓度：通过方阵滴定法确定最佳包被浓度（如0.1-10 μg/mL），避免过高浓度导致信号抑制。
二、抗体与试剂浓度优化
采用“棋盘滴定法”(checkerboard titration) 同时优化捕获抗体、检测抗体和酶标二抗的浓度，以获得最高的信噪比(S/N)或最低的变异系数(CV)。
稀释液: 使用含 0.5-1% BSA 的 PBST 来稀释一抗和二抗，有助于稳定抗体并减少非特异结合。
加样规范: 加样应准确、快速，垂直加入孔底，避免触碰孔壁，并使用新的吸头防止交叉污染。
三、保护液与稳定性优化
酶标板保护：添加糖类、庆大霉素等成分可延长保存期，4℃孵育过夜后37℃加速老化验证。
酶标抗体保护：避免反复冻融，可添加甘油或BSA稳定活性。
信号检测的优化：选择合适的底物和终止剂，以确保在动态范围内可以清晰地检测到信号。例如，TMB和ABTS是常用的底物，而H2SO4常用于终止HRP催化反应。
四、酶结合物的浓度
酶标记抗体的浓度需要优化，以确保信号强度与背景之间有良好的平衡。这通常通过一系列稀释实验来确定。
五、显色时间的控制
了解显色时间与OD值的关系，确保在适当的时间点终止反应，避免信号超出酶标仪的检测上限。
成功的ELISA试剂配比优化是一个系统性的实验过程，需要针对具体的抗原-抗体对和样本类型进行调整。最关键的方法是进行预实验，利用棋盘滴定法找到捕获抗体和检测抗体的最佳工作浓度组合，并优化包被与封闭条件，以实现信号最大化和背景最小化。此外，使用高质量的试剂、精确的移液器和新鲜的缓冲液是保证优化成功的基础。
六、孔间一致性：
使用多通道移液器和洗板机来保持孔间的一致性，减少操作误差。
成功的ELISA试剂配比优化是一个系统性的实验过程，需要针对具体的抗原-抗体对和样本类型进行调整。最关键的方法是进行预实验，利用棋盘滴定法找到捕获抗体和检测抗体的最佳工作浓度组合，并优化包被与封闭条件，以实现信号最大化和背景最小化。此外，使用高质量的试剂、精确的移液器和新鲜的缓冲液是保证优化成功的基础。