小Q：罗工您好，我有个流式问题想请教一下 。
情况是这样的：我要做Treg的流式分型检测，指标有CD4,CD25,CD127,
其中CD25我用的是FITC。上机结果发现，CD25分群很不好，我同时做了同型对照和单阳对照。您能帮我判断下原因吗？因为CD25比较重要，它的染色结果会直接导致Treg的分群结果。
罗工：Treg中使用的指标CD25，它是一个表达比较低的指标，在配色的时候通常需要遵循强弱搭配是原则，即：弱表达的抗原要选择亮的荧光素去标记。
如下是一张抗原密度表达高低的参考图，仅供参考。（样本来源：Human PBMC）。
从下图可以看到CD25是表达相对较低的抗原。
小Q：谢谢罗工，我大概了解问题出现在哪里了。我们这里的仪器是Calibur，是个两激光四通道的仪器，您建议搭配哪个荧光素呢？我这个panel中，PE和APC已经占用了。
罗工：荧光素的亮弱强度是根据染色指数（Stain Index,SI）来判断的，SI是指特定流式细胞仪器上荧光素相对强度，SI越大，荧光素越亮。
如下这个图片就是根据SI将各种荧光素强弱进行分类，可以参考。
因为Calibur只有四个通道，而PE好APC已经占用，所以我推荐您使用BB515。
BB515和FITC是在同一个通道，但是BB515是非常亮的荧光素，所以可以替代FITC染色CD25。
如下CD25-FITC和CD25-BB515的染色结果案例：用BB515有明显的分群效果的。
小Q：谢谢罗工，我再对方案进行重新调整。罗工，我还有另外一个问题。平时抗体用量都是按照之前师兄师姐的经验，没有一个很标准的用量，一般流式抗体的用量怎么推荐呢？您一般是如何推荐的？
罗工：抗体用量最准确的方法就是做一个抗体滴定。这个方法用来确定的抗体用量和抗体浓度，以实现阳性信号尽可能强，而阴性信号尽可能低，得到一个的S/N（信噪比值），S/N的浓度就是你要找的的抗体浓度。
小Q：罗工，这个抗体滴定怎么做呢？罗工：抗体滴定的操作很简单，流程可分为四步：
1、确定起始浓度，如无法确定，通用起点10ug/mL 抗体；
2、倍比稀释，连续稀释6-8个梯度；
3、计算S/N，阳性群体MFI/阴性群体MFI；
4、绘制曲线，S/N最高值对应的抗体浓度或者稀释倍数即为抗体浓度。
比如看如下的图片，是CD4-FITC的抗体滴定结果，通过计算，可以看到，当抗体浓度在0.68ug/mL的时候，S/N是在最高点，所以的抗体使用浓度即是0.68ug/mL。
所以你GET到了吗？
小Q：太谢谢罗工，今天又学到很多。马上要做起来。罗工，最后一个问题：在做抗体滴定的时候有有什么注意事项吗？
罗工：在做抗体滴定的时候需要注意以下几点：
1、抗体滴定的样本浓度与实际试验样本浓度保持一致（推荐106个细胞/mL）；
2、抗体滴定背景干净，保证检测群体中有不表达该指标的阴性细胞；
3、抗体浓度很关键，染色体积增大，抗体量也应该增大；
4、滴定得到的浓度跟细胞数相关，细胞增加会影响染色效果，但是该数量范围很大，10-50倍波动均可行；
5、做抗体滴定时，在文章中写抗体浓度，不要写稀释比哈。
小Q：哇哦，了解，谢谢罗工！
各位小伙伴，除了今天推荐的BB515外，BD公司很多新荧光素跟之前的传统荧光相比确实好用，比如还有BB700。
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