蛋白质免疫印迹（Western Blot, WB）是一种用于检测特定样品或提取物中目标蛋白的分析方法。该技术利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）将蛋白质按分子量大小分离并转移到固相膜载体后利用特异性抗体识别目标蛋白。其检测原理基于抗原-抗体特异性结合，可实现蛋白质的鉴别和半定量分析，广泛应用于蛋白质表达水平检测、修饰状态分析及相关机制探索等领域。 

图 1. 抗体结构（左）和检测原理（右）示意图。

一、实验前准备

实验开始前需要对所研究的目的蛋白在待测样本中的表达水平、蛋白大小、蛋白时空表达特征以及潜在的翻译后修饰等背景信息进行深入的了解，有助于我们设置合适的实验方案。

1.1 蛋白的定位

根据蛋白定位的不同，选择最佳的裂解液，一般选择方案如下：

表 1: 不同裂解液对应靶蛋白定位表

注意：

• （1）特定组分蛋白检测：若目标蛋白在全细胞裂解液中含量较低，可能难以检测到，建议根据蛋白定位提取相应组分，如核蛋白，膜蛋白，线粒体蛋白。

• （2）核蛋白提取：检测核蛋白时，推荐采用超声裂解以提高提取效率。

• （3）分泌型蛋白检测：对于分泌型蛋白，可在细胞培养时加入 BFA（HY-16592）抑制分泌或检测细胞培养上清液。

• （4）跨膜蛋白处理：对于多次跨膜蛋白，建议避免高温煮样，或者可以设置温度梯度进行预实验，以减少蛋白变性和降解。

1.2 蛋白的表达水平

实验前需确定样本中是否表达目的蛋白。
通常会参考文献或数据库进行样本的选择，常用的数据库如下：

（1）网址：https://www.proteinatlas.org/，简称 HPA 数据库，提供人类蛋白质在组织和细胞系中的表达和定位信息。

（2）网址：https://www.phosphosite.org/，蛋白质翻译后修饰数据库，查阅修饰类蛋白的表达条件和丰度、刺激方式等。

（3）网址：http://biogps.org/，可以查询人、小鼠、大鼠中某种蛋白的 mRNA 表达水平。

1.3 蛋白的翻译后修饰

编码蛋白的基因在表达以后，通常还需不同翻译后修饰（post-translation modifications, PTMs）如磷酸化、糖基化、乙酰化、甲基化、泛素化等，才能获得正常的结构与功能。这些翻译后修饰过程受多种修饰酶和去修饰酶等的严格调控，使得蛋白在特定瞬间或时期背景下呈现持续稳定或动态可逆的功能状态。

在进行蛋白检测（如 WB）时，如果蛋白存在翻译后修饰，结果可能会出现分子量大小与预期理论值不符、条带弥散、多条带或条带较弱等情况。如糖基化修饰通常会导致蛋白表观分子量大于预测值。

在蛋白提取和检测过程中，为了最大程度保留目标蛋白的天然修饰状态并避免降解，实验操作中应加入蛋白酶抑制剂（防止蛋白被内源性蛋白酶降解）以及磷酸酶抑制剂（防止已存在的磷酸化修饰被去除），必要时还可根据研究对象选择相应的去乙酰化酶抑制剂或其他特异性抑制剂（如激酶抑制剂）。抑制剂添加能够有效保证目标蛋白的稳定性与修饰完整性，从而获得更准确的检测结果。

常用查询数据库网址：https://www.uniprot.org/，可查询目的蛋白的基因名、别名、功能、可变剪切体、亚细胞定位及可能的翻译后修饰类型等信息，为实验设计与结果分析提供参考。

1.4 蛋白是否存在异构体/剪切体

通过数据库/文献查询靶蛋白是否有异构体以及可变剪切体。如果存在，此类结构差异可能导致 WB 实验中出现多条蛋白条带。为避免遗漏重要信息，建议首次实验时尽量保留完整膜片进行检测。

二、Western Blot 实验流程

 蛋白样本制备 → 电泳 → 转膜 → 封闭 → 孵育抗体→ 显影

图 2. Western blot 的流程图^[1]。

三、蛋白样本制备

目的：细胞裂解是蛋白样本制备的关键环节，目的是释放细胞内的蛋白质，以便后续检测。

3.1 总蛋白提取 (使用 RIPA 裂解液 (强) 为例)

• （1）准备溶液：室温融解蛋白裂解液 RIPA，加入蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物 (50×)，使最终浓度为 1×，混匀，立即放置在冰上。

• （2）不同样本裂解方法

• 对于贴壁细胞：用 4℃ 预冷的 PBS Buffer (1×) 洗 2~3 遍，用细胞刮刀刮下细胞，或用 EDTA 溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，尽可能吸尽上清，留下细胞沉淀备用。细胞样品按 1×10⁶ 细胞数加 100 μL 裂解液，冰上裂解 30 min（或冰上裂解 5 min，超声仪冰浴超声 20 s）。

• 对于悬浮细胞：用 PBS 洗 2~3 遍，离心收集细胞，尽可能吸尽上清，留下细胞沉淀备用。细胞样品按 1×10⁶ 细胞数加 100 μL 裂解液，冰上裂解 30 min（或冰上裂解 5 min，超声仪冰浴超声 20 s）。

• 对于组织样品：剪取适量组织和蛋白裂解液于匀浆器中磨匀（0.01 g 组织加上 50-100 μL 的蛋白裂解液），直至看不见组织块。将组织样品匀浆液转移至 1.5 mL EP 管中，置于冰上蛋白裂解 15 min。12000 rpm，4℃ 离心 10 min，立即吸取上清至一预冷的 1.5 mL EP 管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白。

3.2 蛋白浓度测定

• （1）制备好 BSA 标准品，准备 BCA 工作液 A 液: B 液 = 50:1。样品用预冷 PBS 进行稀释。

• （2）孵育 30 min，酶标仪 562 nm 波长读取各孔 OD 值。根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。

四、电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，简称 PAGE），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术，用于分离蛋白质和寡核苷酸。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

在蛋白质的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开；在 DNA 的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，DNA 呈双链状态泳动，其迁移率会受碱基组成和序列的影响。

在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，由于加入了变性剂——蛋白质变性剂常为 SDS（SDS-PAGE），核酸变性剂常为尿素、甲酰胺等，故其分离仅依据于分子量大小。

在高电压的作用下，所有孔道中的蛋白会同时开始向下迁移，分子量大的蛋白，阻力大，位置靠上，分子量小的蛋白则靠下，示意图如下：

图 3. 电泳示意图。

4.1 制胶 (使用预制胶板请忽略此步骤)

• （1）准备玻璃板，确保两块玻璃板下缘水平且均无豁口，安装时内长外短，用手压实玻璃板及垂直槽制胶架。

• （2）倾斜垂直槽制胶架子装入垂直槽制胶固定架，注意为防止胶片变形漏液体，不要过分用力下压，并确保卡好。

• （3）按照每块 5 mL 配制配制分离胶（1 mm 厚度），轻轻混匀后立即铺板（SDS-PAGE 凝胶配方详见“怎么做 Western blot? 看这一篇就够了！”或直接选购凝胶制备试剂盒）。

• （4）铺板后用异丙醇将分离胶液面压平。

• （5）凝固 40 min 后，吸干异丙醇。用 ddH₂O 轻轻冲洗并吸干。

• （6）按照每块 1.5 mL 配制浓缩胶，并插上合适大小的梳子，注意操作要迅速且水平，不能产生气泡。

• （7）待浓缩胶凝固后，拔下梳子，并把配好的凝胶从制胶架上拆下，用 ddH₂O 将残留在胶板上的胶清洗干净，并用保鲜膜包裹住，立即使用或 4℃ 储存。

4.2 制样

根据实验需求和蛋白特性，选择合适的 SDS-PAGE 蛋白质上样缓冲液制备还原样本或非还原样本，以满足不同实验设计的分析要求。

4.3 上样

尽量保持每个泳道的蛋白量一样，体积尽量一致，空置的泳道用等体积的 1× 上样缓冲液补齐，以避免由于凝胶受力不均而导致最后的一两个样品条带出现上扬现象。

4.4 跑胶

• （1）根据目标蛋白大小特性选择合适的蛋白电泳缓冲液和蛋白 Marker。

• （2）根据 BCA 测定结果，目的蛋白每孔上样量 20 μg-40 μg，内参蛋白每孔上样量 5 μg-10 μg。

• （3）电泳时上层胶使用低电压恒压电泳，80 V，约 30 min。

• （4）溴酚蓝进入下层胶时使用高压恒压电泳，120 V，至溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳。

五、转膜 (湿转)

目的：蛋白质经 SDS-PAGE 分离后，必须及时从凝胶中转移到固相支持物上，固相支持物能牢固结合蛋白又不影响其抗原活性，这使其比直接在凝胶上检测更易操作。

目前常用的膜有 PVDF 膜和 NC 膜，其主要区别如下：

表 2: PVDF 膜和 NC 膜表异同点

5.1 转膜步骤

• （1）准备转膜缓冲液：提前配制好转移缓冲液并预冷至 4℃。

• （2）准备 PVDF 膜和滤纸：将 PVDF 膜在甲醇中浸泡 30 s（从不透明变为半透明），接着用 ddH₂O 冲洗膜表面，最后将膜和滤纸放入转膜缓冲液中。

• （3）处理凝胶：轻轻撬开玻璃板，切掉浓缩胶和周围不需要的区域。将凝胶放入转膜缓冲液中，确保胶的完整性。

• （4）制备转膜“三明治”：三明治夹套的黑色面向下，透明面（或红色面）朝上打开放置在干净的桌面上。从下依次往上放置海绵、滤纸、凝胶、PVDF 膜、滤纸、海绵。确保每一层之间都没有气泡，可以在放置最上层泡沫垫前使用滚轮轻轻滚动，以去除气泡。 

• （5）转膜：将夹套插入转移电泳芯中，确保黑色板朝向黑色板。然后将转移电泳芯放入转膜槽中，加入足够的转膜缓冲液，确保夹套完全浸没在缓冲液中。设置转膜电流为恒流，220 mA，根据蛋白大小不同设置转膜时间。

• （6）转膜后处理：转膜完成后，取出 PVDF 膜，用 PBST 或 TBST 冲洗膜表面，进行封闭等后续步骤。

• （7）（选做）可使用丽春红（Ponceau S）染色液对转膜后的膜片进行染色，以快速验证蛋白转移效果和上样均一性效果。

表 3: 不同分子量蛋白对应转膜时间

5.2 转膜注意事项

• （1）大蛋白转膜注意事项（分子量大于 100 kD）

• 转膜时在电转移缓冲液加入终浓度为 0.1% 的 SDS。

• 甲醇的浓度降至 10% 或更低。

• （2）小蛋白转膜注意事项（分子量小于 20 kD）

• 转膜缓冲液中可以不加 SDS。

• 保持 20% 的甲醇浓度。

• 使用 0.22 μm 孔径的膜。

六、封闭

目的：利用封闭液中的惰性蛋白/化合物与膜上空白位置结合，来减少抗体的非特异性结合。

图 4. 抗体封闭原理图。

将转好的膜置于摇床上，加入 5% 的脱脂牛奶（TBST 配制）或封闭缓冲液，磷酸化蛋白检测用 5% 的 BSA（TBST 配制）缓冲液^[2]，室温封闭 1-2 h 或 4℃ 过夜。

七、抗体孵育

目的：利用特异性抗体结合目的蛋白。

7.1 一抗选择要点

• （1）分析应用类型
  根据所做实验类型选择抗体。MCE 官网在产品页信息“应用”一栏列出了该抗体经实验验证后所适用的实验类型。 如，应用: WB, ICC/IF, IF-Tissue, IHC-P, FC。

• （2）分析样本种属
  根据样本种属选择抗体。MCE 官网在产品页信息“反应物种”一栏列出了该抗体经实验验证后所适用的种属信息。 如，反应种属: Human, Mouse, Rat。

• （3）选择抗体宿主来源
  一般说来，在使用偶联二抗结合无偶联物的一抗时，一抗宿主动物的物种选择较为重要。 为避免抗免疫球蛋白的二抗与样品中的内源性免疫球蛋白间发生交叉反应，所选一抗的来源生物体应与样本中生物体不同。如，若研究小鼠蛋白，则应选择除小鼠外的生物体产生的一抗。假设选兔源的一抗，二抗则可选择偶联了检测分子（酶、荧光素、生物素等）的抗兔 IgG。

• （4）分析目的蛋白的结构区域
  待测样本蛋白区域：确认免疫原（全长蛋白、蛋白质片段、多肽、整个生物体或细胞）与待检测蛋白区域一致或包含在其内。

7.2 二抗选择要点

• （1）种属来源：根据一抗种属来源进行选择，如一抗宿主是小鼠来源，则二抗选择抗小鼠的即可（宿主来源于羊、兔等均可）。

• （2）标记物的选择：根据实验类型不同，来选择二抗的偶联标记。

表 4: 不同实验对应的标记类型

7.3 抗体孵育步骤

• （1）孵育一抗：稀释一抗（TBST 溶解的 5% 脱脂牛奶，磷酸化蛋白使用 TBST 溶解的 5% BSA），室温 1-2 h 或 4℃ 过夜孵育。

• （2）洗膜：使用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

• （3）孵育二抗：TBST 溶解的 5% 脱脂牛奶，磷酸化蛋白使用 TBST 溶解的 5% BSA 室温孵育 1 h。

• （4）洗膜：使用 TBST 洗膜 3 次，每次 10 min。

八、ECL 显影

目的：蛋白质免疫印迹实验常用的检测方法主要有化学发光检测、底物显色检测和荧光检测，目前常用的是化学发光检测，其显色的原理是实验中的二抗被 HRP（辣根过氧化物酶）标记。在碱性条件下，HRP 可以催化 ECL 反应液产生光子信号，进而被 X 射线胶片和化学成像仪捕获。

8.1 ECL 显影步骤

（1）配制 ECL 工作液：按等体积比例混合适量 A 液和 B 液，室温放置备用。

（2）曝光：用移液器吸取合适量的发光液至覆盖 PVDF 膜，ECL 发光仪上曝光并采集图像。

图 5: ACTL6A抗体显影图

九、热门抗体推荐

9.1 MCE产品亮点

高特异性与高亲和力：重组兔单抗为主，有效减少非特异性结合；
广泛适用性：适用于多种实验方法，如 WB、IF、ICC、IHC、mIHC、FC、ChIP、ELISA 等；
严格质量控制：每一批抗体都经过严格的质量检测，确保品质稳定可靠。

9.2 热门靶点抗体推荐

  参考文献:  

[1] Pillai-Kastoori L, et al. Antibody validation for Western blot: By the user, for the user. J Biol Chem. 2020 Jan 24;295(4):926-939.
[2] Ferguson RE, et al. Housekeeping proteins: a preliminary study illustrating some limitations as useful references in protein expression studies. Proteomics. 2005 Feb;5(2):566-71.