谷胱甘肽还原酶(GR)测定试剂盒/分光光度法/48样
测定意义:
GR 是广泛存在于真核和原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶,是谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶之一(通常昆虫中GR 被 TrxR 取代)。GR 催化 NADPH 还原 GSSG 生成 GSH ,有助于维持体内 GSH/GSSG 比值。GR 在氧化胁迫反应中对活性氧清除起关键作用,此外 GR 还参与抗坏血酸-谷胱甘肽循环途径。
测定原理:
GR 能催化 NADPH 还原 GSSG 再生 GSH ,同时 NADPH 脱氢生成 NADP+;NADPH 在 340 nm有特征吸收峰,相反 NADP+在该波长无吸收峰;通过测定 340 nm 吸光度下降速率来测定 NADPH 脱氢速率,从而计算 GR 活性。
自备仪器和用品:
紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、移液器、1mL 石英比色皿和蒸馏水。
操作步骤:
1. 分光光度计预热 30 min ,调节波长到 340 nm,蒸馏水调零。
2. 试剂一置于 25℃(普通物质)或者 37℃(哺乳动物)中预热 30min。
3. 测定管:取 1mL 石英比色皿,依次加入 50μL 试剂三,100μL 试剂二, 750μL 试剂一,100μL 上清液,混匀,于 340nm 迅速测定初始吸光度和 180 s 吸光度,记为 A 测 1 和 A 测 2,△A 测定管=A 测 1 -A 测2 。(注意 :加完上清液后迅速混匀测定)。
注 意:
(1)样品处理等过程均需要在冰上进行,且须在当日测定酶活力,匀浆液避免反复冻融。
(2)试剂二和试剂三须现配现用,配制完后,置于冰上,未使用完的 4℃保存,三天内使用完。
(3)测定前须先用 1~2 个样做预实验,哺乳动物组织一般须用试剂一稀释 2~5 倍。
(4)细胞中 GR 活性测定时,细胞数目须在 300 万-500 万之间,细胞中 GR 的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理,不能用细胞裂解液处理细胞。
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