背景及概述[1]
纤溶酶原（Plg）是纤溶酶的无活性前体，经纤溶酶原激活物激活后成为纤溶酶。人类天然纤溶酶原是一种糖蛋白，分子量92kD，含791个氨基酶，由A、B链组成，因其NH2端为谷氨酸，故又称为谷氨酸纤溶酶原。纤溶酶原的主要产生部位是肝脏，但也存在于其他细胞和大多数细胞外组织。人类谷氨酸纤溶酶原有两种变异型，Ⅰ型是一种双糖基化酶原，Ⅱ型只在苏氨酸部位含有糖基。在无纤维蛋白存在时，Ⅰ型较Ⅱ型更易被激活；但在纤维蛋白存在的条件下，这种差异减小。谷氨酸纤溶酶原可经少量纤溶酶裂解，形成78赖氨酸纤溶酶原。赖氨酸纤溶酶原对纤维蛋白的亲和力强，易被激活，而且半衰期缩短。纤溶酶原在各种纤溶酶原活化剂，如t-PA和u-PA的作用下，在精561-缬562肽键处裂解，形成纤溶酶。在没有α2-抗纤溶酶存在的条件下，谷氨酸纤溶酶原转变为谷氨酸纤溶酶，并进一步在少量纤溶酶的作用下，形成赖氨酸纤溶酶。谷氨酸纤溶酶原也可直接转变为赖氨酸纤溶酶原，再在少量纤溶酶作用下，激活为赖氨酸纤溶酶。在生理情况下，纤溶酶原主要是结合在纤维蛋白上转变为纤溶酶而发挥纤溶作用。
纤溶系统[2]
Plg是一个相对分子质量为90k的血浆酶原，含有5个被称为Kringle结构域(K1~K5)的富含半胱氨酸的多肽，K5后是一个丝氨酸蛋白酶区域。Kringle结构域因其形状类似于一种叫Kringle的丹麦多层蛋糕而得名，它是一种多态的三环结构，由三个二硫键连接而成，这种结构也见于与止血和纤溶有关的其他蛋白质。Plg的K1、K2、K4、K5结构域中包含赖氨酸结合位点(lysinebindingsite，LBS)，此位点可识别Plg受体C-末端的赖氨酸残基，而赖氨酸或赖氨酸类似物(如EACA、氨甲环酸等)可抑制Plg与其受体的结合。由此可见，Plg是通过其LBS与受体结合的。Plg的N-末端为Glu残基，因此也称为Glu-Plg。Glu-Plg通过纤溶酶(plasmin，Pm)的降解作用，释放相对分子质量为8k的激活肽段形成N-末端为Lys残基的Lys-Plg。与Glu-Plg相比，Lys-Plg与受体、目标分子之间结合能力更强，并且更易于转变为Pm。Plg可被纤溶酶原激活剂(plasminogenactivator，PA)激活而转变为有活性的丝氨酸蛋白酶Pm，其激活过程是PA切断Plg分子的Arg560~Val561之间的肽键，形成两条多肽链(一条重链；一条轻链)，彼此由两个二硫键连在一起。重链包含5个K结构域，轻链包含Ser740、Asp645、His602形成的丝氨酸蛋白酶催化活性位点。Pm可降解纤维蛋白和多种细胞外基质成分，例如层黏连蛋白、纤连蛋白，是哺乳动物纤溶系统中的一个重要组份。Pm也参与某些激素原和生长因子的激活。可见，Pm具有极强的蛋白水解能力，这一点也可以被致病菌利用来感染宿主。
激活剂、抑制剂[2]
Plg在哺乳动物体内含量较高，在成人血浆中Plg的浓度为180~200mg/mL。在体内，由专门的纤溶酶原激活剂和抑制剂调节Plg的激活及Pm的活性。哺乳动物有两种纤溶酶原激活剂：组织型Plg激活剂(tPA)和尿激酶型Plg激活剂(uPA)。tPA主要由内皮细胞产生，是Plg的主要激活剂。tPA包含两个Kringle区域、一个类生长因子区、一个氨基末端区。tPA的结构决定了其对纤维蛋白具有高亲和性。uPA由各种正常以及恶性细胞产生，可与细胞表面的uPA受体(uPAR)结合，从而激活Plg，它主要参与细胞在发炎、伤口愈合、组织再生及肿瘤细胞迁移过程中的胞外基质降解。纤溶系统的主要抑制剂属于丝氨酸蛋白酶抑制剂，专门抑制水解蛋白酶的活性。主要的纤溶酶原激活剂的抑制剂是PAI-1、PAI-2等，可抑制tPA和uPA的活性，此外还有PAI-3，但其抑制作用比PAI-1和PAI-2弱。Pm主要的体内抑制剂是a2-抗纤溶酶(a2-antiplasmin，AP)。Pm和受体的结合位点与Pm和AP的结合位点为同一个结合位点——Pm的赖氨酸结合位点，因此Pm和受体的结合可被AP抑制。在血浆中，含量最高的Pm抑制剂是广谱蛋白酶抑制剂a2-巨球蛋白，然而，仅在体内或局部AP浓度明显降低时，Pm才被a2-巨球蛋白抑制。
2Plg／Plm相关疾病及功能[2]
1. 相关疾病基
因突变或天冬酰胺酶等影响会引起Plg缺乏症，包括Ⅰ、Ⅱ型Plg缺乏症。Ⅰ型Plg缺乏症患者体内的Plg含量低于正常水平，临床症状表现为木质化结膜炎，常发生在眼部，可能导致20%～30%患者失明。这种木质化病变在身体其他部位也会发生，如口腔内结节性溃疡、牙龈增生，虽然这种病症不产生疼痛，但会造成牙齿脱落。病变发生在呼吸道将会导致复发性肺炎或呼吸道阻塞，女性患者还有可能发生生殖器病变。该病较为罕见，全球发病率约为1.6／1000000，且无种族特异性。Ⅱ型Plg缺乏症患者体内Plg含量正常，但活性低于正常水平，该类患者患静脉血栓的概率比正常人高，不同种族Ⅱ型Plg缺乏症发病率存在差异，据调查报告显示，Ⅱ型Plg缺乏症在日本发病率为3.83%，在韩国和中国发病率分别为1.6%和1.5%。
2. Plg／Plm的功能
研究发现，注射Plg能清除Plg缺乏患者眼部的病变组织，缓解木质化结膜炎症状。Plg激活后转变成Plm形式，能够将纤维蛋白逐步降解成小的氨基酸片段。Plm依靠丝氨酸蛋白酶结构域发挥溶解蛋白的作用，主要作用于精氨酸和赖氨酸残基形成的肽键，其不仅能够降解纤维蛋白、纤维蛋白原，还可作用于C3、C5、玻连蛋白、骨钙素、凝血因子Ⅴ、Ⅷ、Ⅹ以及伤口诱导形成的聚集蛋白等。Plm在纤维蛋白溶解、细胞外基质降解、细胞转移、组织重构、伤口愈合等方面均发挥作用。
制备
1. 血浆分离提取
1970年，DEUTSCH等首次报道了采用L-Lysine配体亲和层析从人血浆中制备Plg，纯化倍数为200，该技术的突破是Plg纯化工艺研究的里程碑，后人基于L-Lysine亲和层析，经过不断改良层析条件以及增加纯化步骤如离子交换层析、凝胶过滤等，逐渐形成了稳定的制备工艺，并实现商业化发展。2000年，Grifols公司以CohnFⅡ+Ⅲ沉淀为原料纯化Plg。CohnFⅡ+Ⅲ沉淀在低温乙醇法生产白蛋白和球蛋白工艺中属于废弃物，Grifols将其用含赖氨酸的缓冲液重悬，用聚乙二醇和硅藻土去除脂质。重悬液体压滤后经Lysine亲和层析捕获Plg，再经阳离子交换去除赖氨酸，最后用洗脱缓冲液洗脱层析柱，得到纯化的Plg，纯度＞98%。2006年，Kedrion公司根据已有的资料和经验，采用亲和层析从血浆中纯化Plg，选用ECH-LysineSepharose树脂，该树脂对Plg具有更高的亲和力，且对碱耐受性强，便于清洗。在血浆融化后亲和层析前加入了蛋白酶抑制剂抑制蛋白凝结及Plg激活。根据法规要求，采用S／D法灭活脂包膜病毒和纳滤去除病毒两步病毒灭活／去除步骤，保证了制品的安全性。
Plg最终用生理盐水配制成1mg／ml的浓度，于-20～-80℃冻存。对成品进行相关检测，包括蛋白浓度［（1±0.3）mg／ml］、Plg活性（≥5.0IU／ml）、纯度（＞90%）。在≤-70℃和≤-20℃的条件下进行36个月稳定性试验，SDS-PAGE毛细管电泳和分子筛检测显示，Plg的纯度和完整性均＞90%。欧盟委员会和美国食品药品监督管理局（FDA）分别于2007年8月3日和2010年6月7日授予KedrionPlg孤儿药资格。2006年，加拿大ProMetic公司研发了新型亲和树脂用于Plg和Plg类似物的分离、去除、纯化、鉴定等。树脂合成物分为5种类型，经人血浆测试第Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型树脂结合目标蛋白的能力分别为4.75、4.0和17.0mg／ml。ProMetic采用亲和层析（PlgAffinityAdsorbent，ProMeticBioSciences，Ltd）加SulphopropylSepharoseFastFlow离子交换层析从人血浆中纯化Plg，纯度≥95%，活性≥90%，回收率≥60%。ProMetic将Plg成品制成冻干状态，这种状态有利于延长Plg产品的货架期，在2～8℃条件下有效期为3年，大大降低了商业成本。ProMetic公司的Plg产品目前正在进行Ⅱ期临床试验（NCT-02312180）。FDA和欧盟委员会分别于2013年、2015年授予ProMetic公司人血浆纤溶酶原药物治疗血纤溶酶原缺乏症孤儿药资格。
2. 基因重组制备
利用大肠埃希菌表达系统获得两种Plg衍生物，一种由K5结构域、连接区、丝氨酸蛋白酶结构域组成，称为小纤溶酶原（miniplasminogen，miniPlg）；另一种只含有连接区和丝氨酸蛋白酶结构域，称为微小纤溶酶原（μPlg）。用人Plg全长基因序列合成cDNA，优化后的cDNA插入到pET11a的NdeI／BamH1位点构成pET11a-miniPlg，插入到pET11a的BamH1／Xhol位点构成pET11a-μPlg。将重组表达载体转化大肠埃希菌BL21感受态细胞，以包涵体形式表达miniPlg、μPlg。miniPlg通过SepharoseFastFlow离子交换层析和Superdex75分子筛层析纯化，μPlg通过Superdex75分子筛层析和Superdex200分子筛层析纯化，最终蛋白纯度均＞98%。该方法采用的T7启动子与IPTG相比，诱导产生的蛋白量更高，包涵体收获率高达600mg／L。
主要参考资料
[1] 内科学·卷
[2] 纤溶酶原在金黄色葡萄球菌感染中的作用
[3] 人纤溶酶原／纤溶酶的研究进展