阿巴帕肽

背景及概述[1]

甲状旁腺激素(PTH)是一种由甲状旁腺主细胞分泌的，调节体内钙和磷代谢的多肽类激素，其C端肽链与PTH-II受体结合可促进骨细胞凋亡、N端肽链与PTH-I受体结合可促进骨骼重m.建。Lilly公司以人甲状旁腺素(hPTH)N-末端34个氨基酸残基研制的用于治疗骨质疏松症的药物特立帕肽(Teriparatide)于2002年12月被FDA批准上市。阿巴帕肽是由34个氨基酸残基组成的多肽，分子式为C174H300N56O49，分子量为3960.64g/mol，CAS号为247062-33-5，专利公开了阿巴帕肽的制备方法，首先采用固相合成的方法合成3个肽树脂片段，随后将肽片段2和3与肽树脂片段1进行连接。然而该方法肽片段2和3进行缩合之前需要冻干过程，并且肽树脂片段2和3的生成需要使用大量昂贵的2-CTC树脂，导致生产成本增加。因此，亟待开发一种过程简单、成本低，且产品收率高的阿巴帕肽的制备方法。

应用[2]

阿巴帕肽，英文名称为Abaloparatide，是由Radius Health公司研制的一种新型甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)，它是PTH-I受体强有力的选择性激活剂，可以增加骨矿物质含量、骨密度以及骨强度，促进骨骼形成，已于2017年4月28日被FDA批准上市，其商品名称为Tymlos。阿巴帕肽经皮下注射，用于治疗处于骨折风险或对其它治疗药物无效的绝经后妇女的骨质疏松症，可有效降低新发椎体和非椎体骨折率。与特立帕肽相比，阿巴帕肽能够更好的降低骨折率和高钙血症发生率。

制备[1]

一种阿巴帕肽的制备方法：

步骤1：二肽片段Fmoc-Leu-Leu-OH的制备

1)Fmoc-Leu-OSu的合成：将0.1mol Fmoc-Leu-OH和0.11mol HOSu溶于0.2L的THF，置于冰水浴，得混合液Ⅰ；将0.11mol DCC溶于0.1L的THF中，并滴至混合液Ⅰ中，滴加完毕继续反应1h后，将温度升至25℃，保温反应3h后，将反应液过滤、蒸干，再加DCM溶解过滤、蒸干，得固体Ⅰ；加乙酸乙酯将固体Ⅰ溶解后、进行重结晶，得到Fmoc-Leu-OSu。2)Fmoc-Leu-Leu-OH的合成：将0.12mol H-Leu-OH和0.12mol Na2CO3溶于0.2L体积分数50％THF/H2O溶液，得混合液Ⅱ；将Fmoc-Leu-OSu溶于THF中，并滴加至混合溶液Ⅱ中，25℃过夜反应后，将反应液旋蒸，加入体积分数15％柠檬酸调pH至3，用乙酸乙酯萃取3次，合并3次萃取的有机相后，用饱和NaCl溶液洗涤3次，加无水Na2SO4过夜干燥，蒸干溶剂，得固体Ⅱ；再用乙酸乙酯将固体Ⅱ溶解后、进行重结晶，得到Fmoc-Leu-Leu-OH。

步骤2）Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH的制备

1)Fmoc-Arg(Pbf)-OSu的合成：将0.1mol Fmoc-Arg(Pbf)-OH和0.11mol HOSu溶于0.2L的THF中，至于冰水浴，得混合液Ⅰ；将0.11mol DCC溶于0.1L THF中，并滴加至混合液Ⅰ中，滴加完毕继续反应1h后，将温度升至25℃，保温反应3h后，将反应液过滤、蒸干，再加DCM溶解过滤、蒸干，得固体Ⅰ；加乙酸乙酯将固体Ⅰ溶解后、进行重结晶，得到Fmoc-Arg(Pbf)-OSu。2)Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH的合成：将0.12mol H-Arg(Pbf)-OH和0.12molNa2CO3溶于0.2L体积分数50％THF/H2O溶液，得混合液Ⅱ；将Fmoc-Arg(Pbf)-OSu溶于THF中，并滴加至混合液Ⅱ中，25℃过夜反应后，将反应液旋蒸，加入体积分数15％柠檬酸调pH至3，用乙酸乙酯萃取3次，合并3次萃取的有机相后，用饱和NaCl溶液洗涤3次，加无水Na2SO4过夜干燥，蒸干溶剂，得固体Ⅱ；用乙酸乙酯将固体Ⅱ溶解后、进行重结晶，得到Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH。3)Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OSu的合成：将0.1mol Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH和0.11mol HOSu溶于2L的THF中，至于冰水浴，得混合液Ⅲ；将0.11mol DCC溶于0.1L THF中，并滴加至混合液Ⅲ中，滴加完毕继续反应1h后，将温度升至25℃，保温反应3h后；将反应液过滤、蒸干，再加DCM溶解过滤、蒸干，得Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OSu。4)Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH的合成：将0.12mol H-Arg(Pbf)-OH和0.12molNa2CO3溶于0.2L体积分数50％THF/H2O溶液，得混合液Ⅳ；将Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OSu溶于THF中，并滴加至混合液Ⅳ中，25℃过夜反应后，将反应液旋蒸，加入体积分数15％柠檬酸调pH至3，乙酸乙酯萃取3次，合并3次萃取的有机相后，用饱和NaCl溶液洗涤3次，加无水Na2SO4过夜干燥，蒸干溶剂，得Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH。

步骤3：阿巴帕肽-氨基树脂的制备

1)Fmoc氨基树脂溶胀：取20g替代度为0.5mmol/g的RinkAmide MBHA树脂，加入200mL DCM或DMF将树脂溶胀0.5h，抽干溶剂后，再用DMF洗涤树脂两次，抽干溶剂，得氨基树脂固体Ⅰ。2)Fmoc氨基树脂脱Fmoc保护：向步骤1)制得的氨基树脂固体Ⅰ中，加入200mL体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护溶液，在25℃条件下进行两次脱Fmoc保护：次脱Fmoc保护和第二次脱Fmoc保护，次脱Fmoc保护时间为5min，第二次脱Fmoc保护时间为10min后，再用DMF洗涤氨基树脂pH至7，抽干溶剂，得脱保护的氨基树脂。3)氨基酸和肽片段活化：分别将Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH各30mmol与缩合体系：30mmolHOBT和30mmol DIC，用适量的DMF溶解，在25℃条件下反应5min，得活化后的氨基酸和肽片段。4)缩合：将步骤3)制得的活化后的氨基酸和活化后的肽片段加至步骤2)制得的脱除Fmoc保护基的氨基树脂中，在25℃条件下进行氨基酸的缩合反应2h，茚三酮显色反应监控缩合反应进程，逐步缩合活化后的保护氨基酸和肽片段：按照阿巴帕肽主链肽序从C端至N端依次缩合的全保护氨基酸和肽片段顺序为Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH；最终得线性全保护阿巴帕肽-氨基树脂Ala-Val-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Leu-Leu-His(Trt)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Aib-Lys(Boc)-Leu-His(Trt)-Thr(OtBu)-Ala-RinkAmide MBHA树脂；树脂增重率92％。上述茚三酮显色方法：取少量树脂至于试管中，DMF洗涤两次，在试管中分别加入一滴体积分数5％茚三酮-乙醇溶液、一滴体积分数85％苯酚-乙醇溶液和一滴吡啶后，于120℃条件下加热2min后，再用DMF洗涤两次后，观察树脂颜色。5)肽树脂收缩：将步骤4)制得的肽树脂用500mL MeOH和500mLDCM交替洗涤三次，5min/次，抽干溶剂，真空干燥，得阿巴帕肽树脂。

步骤4：阿巴帕肽粗肽的制备

向制得的阿巴帕肽树脂中加入其10倍体积的裂解试剂，在25℃条件下反应3h后，抽滤，将滤液加至其10倍体积预冷的乙醚中进行沉淀、离心，再用乙醚将沉淀洗涤四次，真空干燥得到阿巴帕肽粗肽，裂解试剂为TFA、苯甲硫醚、TIS、EDT和H2O的混合溶剂，其中体积比为TFA:苯甲硫醚:TIS:EDT:H2O＝90:5:2:2:1。经检测阿巴帕肽粗肽纯度为90％。

步骤5：阿巴帕肽粗肽的纯化

对制得的阿巴帕肽粗肽进行纯化、冻干，得阿巴帕肽纯品多肽，具体如下：采用反相高效液相色潽法对阿巴帕肽粗肽进行纯化；反相高效液相色潽法的色谱条件为：反相C18柱，先用流动相A为体积分数0.1％TFA-H2O溶液，流动相B为体积分数0.1％TFA-ACN溶液，将所要的组分收集浓缩；再采用流动相A为体积分数0.1％乙酸-H2O溶液，流动相B为体积分数0.1％乙酸-ACN溶液；两步均为梯度洗脱：流速为80mL/min，洗脱时间为60min，洗脱梯度流动相B相体积百分数为10％～60％，紫外检测波长220nm，对阿巴帕肽纯品换盐，将所需要的组分收集浓缩，冻干，得阿巴帕肽产品。