背景[1-3]
葡糖淀粉酶抗体是可以特异性结合葡糖淀粉酶的一类多克隆抗体，主要用于检测葡糖淀粉酶的Western Blot、IHC-P、IF、ELISA、Co-IP等多种免疫学实验。
检测原理：双抗体夹心法测定标本中葡糖淀粉酶水平。用纯化的葡糖淀粉酶抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入葡糖淀粉酶，再与HRP标记的葡糖淀粉酶抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的葡糖淀粉酶呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中葡糖淀粉酶浓度。
葡糖淀粉酶主要来自枯草杆菌、微生物细菌和曲霉。常采用枯草芽孢杆菌BF7658作为生产菌，以黄豆饼粉(4%~6%)、玉米粉(4%~10%)及一些无机盐为培养基，深层培养40~48h;发酵液用酒精沉淀或硫酸铵盐析即得产品，为了便于保藏，常加入适量的碳酸钙作为抗结剂。黑曲霉变种、米曲霉变种、泡盛曲霉或传统上用于食品的酵母菌、或木霉变种、米根霉变种、地衣形芽孢杆菌在控制条件下发酵培养而成。
葡糖淀粉酶，能水解液态淀粉中的α-1.4糖苷键和α-1.6糖苷键。在水解过程中，由底物分子中的非还原端开始，逐步水解出葡萄糖。水解的速度依赖于的糖苷键的类型和链长。该酶能水解液态淀粉中的α-1.4糖苷键和α-1.6糖苷键。在水解过程中，由底物分子中的非还原端开始，逐步水解出葡萄糖。水解的速度依赖于的糖苷键的类型和链长。
应用[4][5]
用于糖化酵母葡萄糖淀粉酶基因在酿酒酵母中克隆与表达研究
采用遗传工程来构造出能够直接水解淀粉生成酒精的工程菌株,新型菌株可以以淀粉为原料高效生产酒精,并且使酒精产量大大提升。在工业生产上,在以淀粉为原料生产葡萄糖果糖糖浆工艺中,葡萄糖淀粉酶被广泛利用。但现有葡萄糖淀粉酶菌株分泌表达量较低,本实验目的是将葡萄糖淀粉酶基因导入到酿酒酵母中以构建一株重组的酿酒酵母菌株,重组菌株能高效表达并分泌葡萄糖淀粉酶水解淀粉。
实验根据NCBI中Genebank数据库中的序列信息,采用PCR方法从糖化酵母中提取总DNA,并扩增出葡萄糖淀粉酶基因STA1,然后将PCR产物连入pUM-T载体构建成为重组质粒pUM-T-stal,将重组质粒转入大肠杆菌,并进行测序,成功克隆得到STA1重组质粒。将提取的重组质粒pUM-T-stal用BspDI和Acc65I酶切得到STA1并且转入到酿酒酵母表达质粒pRS416中,取名为pRS416-stal。
重组质粒pRS416-stal转化入酿酒酵母感受态菌种中,获得高效表达STA1工程菌。通过诱导表达,重组的酿酒酵母葡萄糖淀粉酶酶活最高为120U/mL。测定葡萄糖淀粉酶酶学性质,结果为其最适温度为60℃,40℃～70℃下稳定性良好；其最适pH为5,在pH为4-6之间稳定性良好。反应2h后酶活依然稳定,剩余酶活能达到90%以上。
参考文献
[1]An autocatalytic kinetic model for describing microbial growth during fermentation[J].Albert Ibarz,Pedro E.D.Augusto.Bioprocess and Biosystems Engineering.2015(1)
[2]Mucosal C‐terminal maltase‐glucoamylase hydrolyzes large size starch digestion products that may contribute to rapid postprandial glucose generation[J].Byung‐Hoo Lee,Amy Hui‐Mei Lin,Buford L.Nichols,Kyra Jones,David R.Rose,Roberto Quezada‐Calvillo,Bruce R.Hamaker.Mol.Nutr.Food Res..2014(5)
[3]Immobilization ofα‐amylase via adsorption onto bentonite/chitosan composite:Determination of equilibrium,kinetics,and thermodynamic parameters[J].Zübeyde Baysal,Yasemin Bulut,Murat Yavuz,?etin Aytekin.Starch‐St?rke.2014(5-6)
[4]Diurnal profiles of salivary cortisol and alpha-amylase change across the adult lifespan:Evidence from repeated daily life assessments[J].Urs M.Nater,Christiane A.Hoppmann,Stacey B.Scott.Psychoneuroendocrinology.2013(12)
[5]郭彦言.糖化酵母葡萄糖淀粉酶基因在酿酒酵母中克隆与表达[D].长春工业大学,2015.