三糖铁（TSI）琼脂培养基中乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例为10:10:1，培养基中葡萄糖含量少，乳糖和蔗糖多。由于对糖的利用不同，不同细菌在底层产酸、斜面产酸、产生硫化氢和产气上有不同表现。这三种糖中，由于葡萄糖的阻碍作用，细菌首先利用葡萄糖（如大肠埃希氏菌在含葡萄糖和乳糖时，葡萄糖阻遏大肠埃希氏菌乳糖分解酶系的合成，葡萄糖耗尽后，中间有一个延滞期，再利用乳糖）。底层产酸变成黄色，表明能发酵葡萄糖。斜面产酸表明至少能有氧利用乳糖和蔗糖中的一种。
只能利用葡萄糖的细菌，在斜面上进行有氧呼吸，培养基中少量葡萄糖被彻底氧化变成二氧化碳和水，不足以改变指示剂的颜色。或者细菌利用蛋白胨中的氨基酸脱羧作用，产生碱性物质使斜面变碱，红色加深。底部由于是在厌氧状态下，氧化一还原电位适合发酵产酸，酸类不被氧化，即使是发酵少量葡萄糖，也能使指示剂改变颜色。而假单胞菌、产碱菌等专性需氧菌因缺氧在底层不产酸表现为红色。因培养基中可能有微量硝酸盐，有的专性需氧菌进行硝酸盐呼吸，微弱产酸变为橘黄色，但不能根本上改变颜色显黄色。
而发酵乳糖或蔗糖的细菌，则产生大量的酸，使整个培养基指示剂的颜色改变，呈现黄色。如培养基接种后产生黑色沉淀，是因为某些细菌能分解含硫氨基酸，生成硫化氢，硫化氢和培养基中的铁盐（Fe2十）和硫代硫酸盐反应，生成黑色的硫化亚铁沉淀。
不同细菌可发酵不同的糖，如肠杆菌科的志贺氏菌都能分解葡萄糖，产酸不产气，大多不发酵乳糖，不产生HZS，在TSI选择培养基上无黑色沉淀，斜面变红，底部仍保持黄色。
而沙门氏菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖，产生H,S,所以在TSI选择培养基上有黑色沉淀，斜面变红，底部仍保持黄色。大肠埃希菌则可发酵葡萄糖和乳糖，产酸产气，且不产生H,S，在TSI选择培养基上无黑色沉淀，斜面变黄，底部保持黄色。故可利用此试验鉴别肠杆菌科的这些细菌。
(2）培养基 三糖铁琼脂培养基。
(3）试验方法 以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物，先穿刺接种到TSI深层，距管底3-5mm为止，再从原路退回，在斜面上自下而上划线（图2-15)，置（36±1)℃培养18一24h，观察结果。
(4）结果 产生黑色沉淀即表明产生了HZS；发酵乳糖或蔗糖的细菌使整个培养基呈现黄色；只能利用葡萄糖的细菌则斜面变红，底部仍保持黄色。见图2-160
(5)应用 本培养基适合于肠杆菌科的鉴定。用于观察细菌对糖的利用产酸产气和硫化氢（变黑）的产生情况。
革兰氏阴性菌在三糖铁上的反应如下：肠道杆菌科和弧菌科底层产酸，变为透明黄色，斜面产酸或产碱。非发酵型革兰氏阴性菌斜面产碱或不变，底层产碱或不变或微产酸变成橘黄色。
若单纯检验硫化氢产生情况，用醋酸铅纸条法比三糖铁法更为敏感。有的菌或菌株在三糖铁上硫化氢阴性，但用醋酸铅试纸条时表现为硫化氢阳性，如空肠弯曲菌。
三糖铁（TSI）琼脂培养基反应模式是许多杆菌鉴定表的组成部分．也可作为观察其他培养基反应的有价值的质控依据。
克氏双糖铁（KIA）培养基中含葡萄糖和乳糖，反应原理和三糖铁（TSI）琼脂培养基相同，在肠杆菌科的细菌鉴定中经常使用。