背景[1-3]
荧光素酶标记试剂盒以萤光素为底物，检测萤光素酶（firefly）报告基因的活性。该方法具有操作简单、检测快捷、灵敏度高等优点。
荧光素酶（Luciferase）是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称，其中最有代表性的是来自北美萤火虫（Photinus pyralis）体内的荧光素酶。萤火虫荧光素酶属于加氧酶（oxygenase），其发光反应需要O2和Mg2+参与；有辅酶A（CoA）存在时能提高反应效率，增加发光时间。萤火虫荧光素酶无需翻译后修饰，即可表现出荧光素酶活性。
荧光素酶标记试剂盒
来源于萤火虫的荧光素酶（Luciferase）是一种在研究基因功能与调控过程中使用广泛的报告基因，其灵敏度是标准氯霉素乙酰转移酶（CAT）检测技术的1000倍.荧光素酶催化荧光素的羧化氧化，这是已知的最高效的生物荧光反应.发射出高强度光可以用荧光计来记录。
实验步骤
1.配制试剂
（1）Lysis Buffer：Lysis Buffer(5X)用水稀释5倍，配制成工作液；
（2）Luciferase Reaction Reagent：用Luciferase Reaction Buffer（10 ml）溶解Luciferase Reaction Substrate干粉（短暂离心再开盖），混匀后分装、避光保存，避免反复冻融。
2.裂解细胞
细胞裂解时密度应小于95%，细胞生长过密，易导致裂解不充分；质粒瞬转、病毒感染细胞后，需培养一段时间（一般48小时）使萤光素酶充分表达；调节实验参数，以满足上述条件；去除培养基，用PBS润洗一遍，注意不要将细胞吹起；加入适量的Lysis Buffer。
将细胞培养板置于摇床上，室温、轻晃孵育15分钟；
将裂解物转移到新的EP管中，4℃、12,000rpm离心1分钟，取上清备用。
应用[4][5]
用于溶瘤腺病毒Ad-VT对荧光素酶标记人肺癌细胞的抑制作用研究
通过建立荧光素酶标记人肺癌细胞A549-luc和BALB/c裸鼠皮下荷瘤模型,来探讨溶瘤腺病毒Ad-VT对A549-luc细胞的抑制作用。
方法:1.荧光素酶标记人肺癌细胞的构建与鉴定通过质粒转染与G418加压筛选、荧光素酶活性及稳定性和体外成像等方法筛选出稳定表达荧光素酶的人肺癌细胞,并进行了A549-luc细胞和A549细胞的生长特性、迁移和侵袭能力及细胞周期等生物学特性的检测。
2. 溶瘤腺病毒Ad-VT对荧光素酶标记人肺癌细胞的体外抑制作用研究通过结晶紫染色和WST-1研究Ad-VT对A549-luc细胞和A549细胞的杀伤作用,并从线粒体膜电位（JC-1染色）、细胞核（Hoechst染色）和细胞膜（AnnexinV-FITC/PI染色）等的形态学变化验证Ad-VT对A549-luc细胞和A549细胞的杀伤途径,再通过划痕实验、Transwell小室迁移和BioCoat小室侵袭等研究Ad-VT对A549-luc细胞和A549细胞的迁移和侵袭能力影响。
3.溶瘤腺病毒Ad-VT对荧光素酶标记人肺癌细胞的体内抑制作用研究通过对BALB/c裸鼠的右后肢近背部区域皮下接种A549-luc细胞,成功建立皮下荷瘤模型后,随机分成六组;从0W开始,用活体成像系统每周拍照一次,并用游标卡尺测量肿瘤大小,连续测定6W7W;2W后用重组腺病毒开始治疗,连续治疗4W,研究溶瘤腺病毒Ad-VT对肿瘤的抑制效果和小鼠生存期的影响。
参考文献
[1]In vivo bioluminescence imaging using orthotopic xenografts towards patient’s derived-xenograft Medulloblastoma models[J].Fatemeh Asadzadeh,Veronica Ferrucci,Pasqualino De Antonellis,Massimo Zollo.The Quarterly Journal of Nuclear Medicine and Mol.2017(1)
[2]Apoptosis,autophagy&endoplasmic reticulum stress in diabetes mellitus[J].Levent Demirtas,Aydin Guclu,Fatih Erdur,Emin Akbas,Adalet Ozcicek,Didem Onk,Kultigin Turkmen.Indian Journal of Medical Research.2016(4)
[3]Interview with Robert Coffin,inventor of T-VEC:the first oncolytic immunotherapy approved for the treatment of cancer[J].Robert Coffin.Immunotherapy.2016(0)
[4]Multicolor Bioluminescence Obtained Using Firefly Luciferin[J].Masahiro Kiyama,Ryohei Saito,Satoshi Iwano,Rika Obata,Haruki Niwa,Shojiro A.Maki.Current Topics in Medicinal Chemistry.2016(24)
[5]范园园.溶瘤腺病毒Ad-VT对荧光素酶标记人肺癌细胞的抑制作用研究[D].中国人民解放军军事医学科学院,2017.