背景[1-3]
植物细胞转染试剂盒可以将质粒、Cas9/sgRNA等蛋白和RNA转染进入植物原生质体内。经转染的植物原生质体经过一段时间的培养后，可用于检测外源基因的表达和功能、也可以观测到目的基因的表达调控。
植物原生质体通常是指植物细胞去除细胞壁后，由质膜所包围的部分细胞物质。由于其拥有无细胞壁的物理障碍、具有全能性、组织培养可进行大量繁殖等特点，原生质体是开展一系列植物细胞研究的重要材料。
以拟南芥原生质体为例，使用本试剂盒转染质粒后，通常2-6小时就可以检测到相关基因的转录变化；2-16小时后可以检测到相关蛋白表达的变化；24小时后则可以检测到基因编辑情况。
植物细胞转染试剂盒
转染原理：
本试剂盒采用优化后的聚乙二醇转染方法，借助聚乙二醇短时间内对原生质体产生的冲击效应，使质粒DNA、RNA或蛋白能够进入原生质体，不仅使用起来十分便捷，同时还具有超高的转染效率.
使用方法：
在2ml的圆底离心管中加入20μg p35SPPDK-EGFP-Flag(植物用绿色荧光蛋白)，加入100μl制备好的原生质体，轻柔混匀后加入110μl当日配制好的转染试剂溶液，轻柔混匀，室温静置5min后加入440μl终止液，轻轻颠倒混匀，室温100g离心1min，去除上清，再加入0.5ml终止液，轻柔重悬原生质体，室温100g离心1min后，尽量去除上清，收集原生质体。加入1ml培养液，小心重悬原生质体后将其平置25℃培养过夜(约16h)，次日于荧光显微镜下检测EGFP荧光信号。
应用[4][5]
用于肠出血性大肠杆菌O157：H7植物疫苗的研究
通过对生菜中表达的来源于E.coli O157:H7的EspA生物学特性的研究,证实了大肠杆菌的EspA可以作为植物疫苗研究中的免疫原。
首次在植物细胞内进行了E.coli O157:H7表面蛋白EspA的瞬时表达及稳定表达研究,并分别对以两种体系中表达的重组蛋白进行了动物实验。实验通过试验小鼠的多克隆EspA抗体的体内及体外保护性试验,证实了免疫试验小鼠产生的多克隆EspA抗体的对HeLa细胞的保护性作用,并通过E.coli O157:H7⊿stx-B突变株的小鼠攻毒后的肠道病理研究发现EspA免疫后的小鼠具有对E.coli O157:H7⊿stx-B的抵抗力。
在生菜中采用瞬时表达体系表达了E.coli O157:H7的EspA蛋白。将构建好的pBI121-espA,pBI121-ΩespA载体通过液氮冻融法分别导入农杆菌AGL1,EHA105,LBA4404,GV3101和C58C1后,将带有重组质粒的农杆菌在卡那抗性和利福平抗性的YEB培养基中扩大培养,采用真空法转染培养14天的无菌生菜小苗,转染生菜在22℃培养3天后,检测各菌株转染生菜后EspA的表达水平。
试验发现农杆菌AGL1转染的生菜中EspA的表达量最高,农杆菌LBA4404转染的生菜的EspA的量最低,通过检测pBI121-espA和pBI121-ΩespA转化农杆菌GV3101后通过真空法转染生菜,发现pBI121-ΩespA组具有比较高的EspA表达量,通过对瞬时体系中重组蛋白的表达研究,确定了不同农杆菌菌株在生菜瞬时表达系统中的不同的转染能力,这是首次在生菜瞬时表达的系统中进行此类综合研究。
通过免疫小鼠的实验证实生菜细胞内瞬时表达的EspA能够刺激小鼠产生高水平的IgG和IgA抗体,这是首次关于植物表达E.coli O157:H7的主要免疫原EspA的疫苗报道。
参考文献
[1]Immunogenicity of a novel Stx2B–Stx1B fusion protein in a mice model of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 infection[J].Xiang Gao,Kun Cai,Jing Shi,Hao Liu,Xiaojun Hou,Wei Tu,Le Xiao,Qin Wang,Hui Wang.Vaccine.2009(14)
[2]Effects of a Siderophore Receptor and Porin Proteins-Based Vaccination on Fecal Shedding of Escherichia coli O157:H7 in Experimentally Inoculated Cattle[J].Thornton,A B,Thomson,D U,Loneragan,G H,Fox,J T,Burkhardt,D T,Emery,D A,Nagaraja,T G.Journal of Food Protection.2009(4)
[3]Subcutaneous and intranasal immunization with type III secreted proteins can prevent colonization and shedding of Escherichia coli O157:H7 in mice[J].Shawn Babiuk,David J.Asper,Dragan Rogan,George K.Mutwiri,Andrew A.Potter.Microbial Pathogenesis.2008(1)
[4]Viral vectors for the expression of proteins in plants[J].Yuri Gleba,Victor Klimyuk,Sylvestre Marillonnet.Current Opinion in Biotechnology.2007(2)
[5]栾婧婧.肠出血性大肠杆菌O157：H7植物疫苗的研究[D].山东大学,2009.