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纤维蛋白原的5种提取方法比较研究

发布日期:2022/1/27 9:45:43

背景及概述

纤维蛋白原即凝血因子I(FactorI),是凝血系统“中心”蛋白之一。在所有的凝血因子中纤维蛋白原含量最高;在血浆中其浓度约2~5g/L,是可溶性的糖蛋白,等电点是5.5,沉降常数是7.7~7.9,由肝细胞和巨核细胞合成,见下图。纤维蛋白原在体内以溶解状态存在,经凝血酶作用转变为纤维蛋白发挥其凝血功能,并参与体内感染、炎症、组织损伤修复等一系列病理、生理过程。纤维蛋白原是凝血过程中的底物,其制剂适用于先天性无或低纤维蛋白原血症以及纤维蛋白原含量低下而引起的异常出血和需实施手术的病人,外用纤维蛋白原主要被制成纤维蛋白原粉(止血粉)及止血绷带等用于止血。目前研究报道称纤维蛋白原与纤维生长因子FGA-2结合能促进内皮细胞的增殖,为纤维蛋白原的应用开辟了新的途径,近年来纤维蛋白原在医疗应用领域倍受关注,其发展前景甚是广阔。

图1 纤维蛋白原多维结构图

制备

中国具有丰富的猪血资源,但是由于生产工艺条件研究不够成熟,导致猪血资源的利用率尚不到1%。2006年首次用冻融法提取猪血纤维蛋白原,1L血浆可提得纤维蛋白原2.67g,样品中纤维蛋白原含量达82.6%,提取率达91.0%。制备的纤维蛋白原样品中纤维蛋白原含量为84.3%,纤维蛋白原提取率为88%;用冻融法提取分离得到的纤维蛋白原的含量为2.81g/L,其提取率为89.05%;用冷乙醉沉淀法和离子交换层析法分离纤维蛋白原,纤维蛋白原样品中纤维蛋白原含量分别为71.1%和68.0%,提取率分别为88.1%和95.0%;用改良冷沉淀法提取纤维蛋白原,与传统沉淀法比较;改良冷沉淀法得到的纤维蛋白原含量为(196.4±23.3)mg/200mLFFP(新鲜冰冻血浆),而传统沉淀法得到的纤维蛋白原含量为(184.6±21.7)mg/200mLFFP,这表明改良冷沉淀法比传统沉淀法的提取率高;用反复冷沉淀法提取纤维蛋白原,提取所得纤维蛋白原的平均浓度为(54.2±19.9)g/L;考察了四种沉淀方法(冷冻法、乙醇法、聚乙二醇法和硫酸铵沉淀法)对猪血浆中纤维蛋白原分离的影响,认为硫酸铵沉淀法的分离效果最优。文献中关于纤维蛋白原提取方法的建立与优化的报道甚少,并且关于各个提取方法的优缺点尚未见报道,因此,本研究选择反复冷沉淀法、经典冷沉淀法、冷乙醇法、硫酸铵沉淀法和聚乙二醇沉淀法5种提取方法,通过对以上各种提取方法反复实验,以单次血液处理量、制备流程耗时、纤维蛋白原的浓度,是否需要添加化学试剂和纤维蛋白原的纯度为考察指标,进行对比分析研究,确定最优提取方案,为完善纤维蛋白原提取方法和临床应用研究提供参考,并为提高猪血资源综合利用率、减少浪费和环境污染提供一种新的思路。

提取方法

经典冷沉淀法:取抗凝全血40mL,4℃低温下,按照2000~4000r/min离心10min。获得的血浆-80℃深低温冷冻处理1~6h。4℃下解冻至全部融化即得到纤维蛋白原产物。

反复冷沉淀法:重复冷沉淀中冷冻与融化步骤2~3次,其余操作相同。

冷乙醇沉淀法:0℃预冻10%乙醇。与24~32mL血浆充分混合,离心15min取沉淀。

硫酸铵沉淀法:将3~5mL血浆与1mL饱和硫酸铵充分混合,按照3000r/min离心3~15min取沉淀。

聚乙二醇沉淀法(PEG沉淀法):将4.5mL抗凝血按照2000r/min离心15min,分离并保存上层血浆。血浆于BaSO4(2.25g)和MgSO4(0.01235g)孵育1h。缓慢倒出上层血浆,加入30%PEG(分子量1000)溶液(枸橼酸缓冲液,pH7.4),使成10%(W/V)PEG混合液。按照10000r/min离心20min,取沉淀。

以上每种方法重复5次,测定获得的纤维蛋白原产品的浓度与纯度,并对数据进行统计学分析。数据分析纤维蛋白原含量测定采用Jocobsson法、总蛋白浓度测定采用双缩脲法、提取纤维蛋白原产品的浓度与纯度计算方法为:纤维蛋白原浓度ρ/(g/L)=(A280-A315)×稀释倍数/15.87(式中A280和A315分别为待测的稀释后纤维蛋白原溶液在280nm和315nm波长的吸光度,15.87为纤维蛋白原在碱性条件下280nm的吸光系数);纤维蛋白原纯度=纤维蛋白原浓度/总蛋白浓度×100%。对测定的数据使用统计软件SPSS18.0进行统计学处理,计量资料以平均数±标准差表示;采用t检验进行样本均数比较,用方差分析法进行组内比较,当P<0.05时,差异显著,具有统计学意义[1]。

结论

通过对实验设定的5种纤维蛋白原的提取方法的比较研究,以及对结果的综合分析得出:反复冷沉淀法提取的纤维蛋白原纯度较高,血液处理量较大,提取效率较高,是5种方法中最佳的纤维蛋白原提取方法。反复冷沉淀法在纯度和提取率方面,均比李冻融法即经典冷沉淀法和冷沉淀法高,但提取周期比徐利强的略长;与冷乙醇法相比,得到的纤维蛋白原的纯度略低,但单次处理血量远大于冷乙醇法,这更适合于工业化生产。本实验在纤维蛋白原纯度和生产周期等后续实验方面有待进一步改进,将在今后的实验中对提取得到的纤维蛋白原进行纯化,如选用离子交换层析法等分离和纯化。此外为了提高提取效率,缩短提取周期,将在提取过程中采取一些改进方法,如在解冻抗凝血浆的过程中采用恒温循环水浴、振荡等方法,最终达到优化反复冷沉淀法提取纤维蛋白原的目的,为提取猪血纤维蛋白原的工业化生产提供依据。

参考文献

[1]徐利强,李建华,周忠英.冷沉淀凝血因子制备工艺的改良[J].中国生化药物杂志,2011,32(2):145-146.

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