背景[1-3]
酸性磷酸酶(ACP)测定试剂盒(分光光度法)是利用酸性磷酸酶分解磷酸苯二钠，产生游离酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安替吡啉作用经铁氰化钾氧化生成红色醌衍生物，根据红色深浅可以测定酶活力的高低。
所需仪器及自备试剂：
1、分光光度计/酶标仪/半自动生化分析仪（比色测定波长为520nm）
2、恒温水浴箱或气浴箱（孵育温度为37℃）
3、漩涡混匀器
4、微量移液器
样本收集与前处理：
血清（浆）、培养上清：可直接测定。
动物组织样本：可用生理盐水按重量体积比制备成组织匀浆液，离心取上清测定。
培养细胞、植物组织：常用PBS作为匀浆介质破碎后离心取上清测定。
酸性磷酸酶(ACP)
操作流程：
1、按步骤取样本50l和试剂R1、R2
2、漩涡混匀，37℃孵育30分钟
3、加入R3、R4，室温静置10分钟
4、520nm波长，1cm光径，比色
比色分析是基于溶液对光的选择性吸收而建立起来的一种分析方法,又称吸光亮度法。有色物质溶液的颜色与其浓度有关，溶液的浓度越大,颜色越深，利用光学比较溶液颜色的深度,可以测定溶液的浓度。根据吸收光的波长范围不同以及所使用的仪器精密程度,可分为光电比色法和分光亮度法等。
比色分析具有简单、快速、灵敏度高等特点,广泛应用于微量组分的测定.通常中测定含量在10-1～10-4mg·L-1的痕量组分，比色分析如同其他仪器分析一样,也具有相对误差较大（一般为1%～5%）的缺点。但对于微量组分测定来说,由于误差很小,测定结果也是令人满意的。在现代仪器分析中,有60%左右采用或部分采用了这种分析方法。
分光光度计使用时测定出来的吸光度值或透射比值是相对于一个标准品做空白测出来的,否则测定出来的样品的值是没有依据的。标准品一般是指不含被测物质或和被测样品除了被测物质之外含有一样的组分,以此来做标准,然后被测定样品吸收的单色光与之进行对比得到的测量数据。
应用[4][5]
用于基于金纳米表面壳的原位生长构建比色法检测酪氨酸酶，酸性磷酸酶和α-葡糖苷酶研究
利用贵金属纳米材料的光学性质、催化性质及信号放大作用设计了三个不同的方法用于三种不同生物酶的检测,分别为酪氨酸酶,酸性磷酸酶,α-葡糖苷酶。
研究结果:1)酪氨酸酶（TYRase）是一种重要的含铜酶,与生物体内色素的形成有关。基于在金纳米颗粒表面原位还原银离子建立了TYRase的比色分析法。在金纳米粒子（Au NPs）的催化作用下,曲酸（KA）可以将银离子还原成银原子沉积在金种子表面,形成核壳结构的Au@Ag NPs;而当加入TYRase时由于其能与KA优先结合而降低了KA的浓度,从而能有效地抑制Ag壳层的形成,引起检测体系明显的颜色和光谱变化。在实验条件下,能有效地检测TYRase,其线性范围为0.13 U·m L-1～0.73 U·m L-1,检测限为0.019 U·m L-1。基于TYRase活性变化引起的颜色变化,我们借助了智能手机定量检测人血清样本中的TYRase,回收率为71～89%,符合生物样品分析要求,这表明了该方法具有潜在的应用性。
2) 基于金纳米颗粒催化苯胺的原位聚合建立了酸性磷酸酶（ACP）的比色分析法。过硫酸铵（APS）可在酸性条件下氧化聚合苯胺,且在Au NPs存在时,在十二烷基硫酸钠（SDS）的辅助下,可形成金-聚苯胺核-壳纳米颗粒（Au@PANI NPs）。合成的Au@PANI NPs在530 nm和705 nm处有相应的吸收峰。同时发现Au NPs可以加速苯胺的聚合过程,缩短反应时间。而在引入抗坏血酸（AA）后,由于AA通过氧化还原反应消耗氧化剂APS,从而抑制了PANI的形成。
3) 因此,通过催化水解2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐（AAP）而释放AA,可以实现ACP的定量检测。随着ACP活性的增加,705 nm处的吸光度(A705)与530 nm处的吸光度(A530)的强度比逐渐降低,颜色逐渐由深绿色变为浅绿色,再到蓝灰色,到紫色,最后变为粉红色。该方法的线性范围为0.40～2.00 14 U·L-1,检出限为0.043 U·L-1。以正钒酸钠为ACP抑制剂模型,应用此方法建立了抑制率与抑制剂浓度的关系,所得的半抑制浓度为1.21μМ。同时应用此方法测定人血清中ACP的含量。回收率为81.0%～104.6%,相对标准偏差小于5%,满足生物样品分析的要求。
参考文献
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[2]A colorimetric method for screeningα-glucosidase inhibitors from flavonoids using 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine as a chromogenic probe[J].Liu Dong-Mei,Dong Chen,Ma Run-Tian.Colloids and Surfaces B:Biointerfaces.2021
[3]Advances and prospects on acid phosphatase biosensor[J].Yangxia Han,Kaijun Quan,Jia Chen,Hongdeng Qiu.Biosensors and Bioelectronics.2020
[4]A colorimetric sensing strategy based on enzyme@metal-organic framework and oxidase-like IrO2/MnO2 nanocomposite forα-glucosidase inhibitor screening[J].Zhong Yingying,Li Qing lan,Lu Minglei,Wang Tiantian,Yang Huiyi,He Qiyi,Cui Xiping,Li Xiangguang,Zhao Suqing.Microchimica Acta.2020(12)
[5]刘晖.基于金纳米表面壳的原位生长构建比色法检测酪氨酸酶，酸性磷酸酶和α-葡糖苷酶[D].南昌大学,2021.